Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 492, № 1, стр. 317-319

При окислении диоксидом свинца в толуоле суммарных липидных экстрактов Mytilus galloprovincialis L. (гонады) и Squalus achantias (печень) методом ЭПР-спектроскопии были зарегистрированы при температуре +24°С стабильные свободные радикалы с идентичным редокс-фрагментом [1]. Анализ спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) позволил сделать предположение о наличие в суммарных липидах морских гидробионтов природной молекулярной структуры, которая после реакции одноэлектронного переноса с неорганическим окислителем (диоксидом свинца) при комнатной температуре трансформировалась в стабильный свободный радикал. Вероятная модель редокс-фрагмента природного стабильного свободного радикала представляет собой гетероцикл с двумя близко расположенными атомами азота (например, как в пиримидине), которые связаны резонансной проводимостью [1]. Гетероциклические молекулярные структуры в конденсированном состоянии могут обладать флуоресценцией [2].

Целью исследования было изучение спектров возбуждения флуоресценции не окисленных и окисленных диоксидом свинца в гексане суммарных липидных экстрактов Mytilus galloprovincialis L. (гонады) и Squalus achantias (печень), которые демонстрируют при окислении парамагнитные свойства.

Флуоресцентная спектроскопия широко используется для исследования флуоресценции липидов в качестве маркера перекисного окисления липидов (ПОЛ) in vitro и радикальных цепных реакций in vivo [2, 3]. Метод позволяет проанализировать механизмы и пути образования флуоресцирующих продуктов, изменения их структурных свойств и формы межмолекулярного взаимодействия [4, 5]. Флуоресцентный анализ во много раз превосходит чувствительность таких методов как спектрофотомерия, ЯМР спектроскопия и ЭПР спектроскопия, позволяя определять очень низкие концентрации исследуемых молекул [5].

Флуоресцирующие продукты ПОЛ имеют максимум испускания в области 430–470 нм при двух максимумах возбуждения в диапазонах 260–280 и 350–390 нм, которые были идентифицированы как шиффовы основания (азометины) [6]. Флуоресцентные свойства проявляют также природные жирорастворимые витамин А (ретинол) и витамин Е. Ретинол имеет максимум флуоресценции в области 460–490 нм при максимуме возбуждения в диапазоне 335–360 нм [2]. Гексановые экстракты витамина Е имеют максимум флуоресценции в диапазоне 320–325 нм при возбуждении в диапазоне 292–295 нм [7].

Мешающим фактором при исследовании природных флуорофоров могут быть ароматические углеводороды. По литературным данным известно, что двустворчатые моллюски рода Mytilus и другие морские гидробионты могут накапливать в тканях значительные концентрации углеводородов [8]. Углеводороды имеют максимумы возбуждения и испускания флуоресценции соответственно 305–390 нм и 400–580 нм [8, 9].

Суммарные липидные экстракты из тканей Mytilus galloprovincialis L. (гонады) и Squalus achantias (печень) получили методом, описанным в работе [1].

Спектры возбуждения флуоресценции липидных экстрактов регистрировали на флуориметрической приставке к спектрофотометру Specord–M40. Чтобы исключить влияние известных природных флуорофоров на спектры возбуждения флуоресценции исследуемых липидных экстрактов, был выбран рабочий диапазон длин волн 280–330 нм и отсекающий светофильтр WK-38/GG 13/ желтый – 363 нм. Стандарт флуоресценции GVD 37-79 /GG 17/: 238–526 нм. Длина оптического пути герметичной кварцевой кюветы – 10 мм. Значение флуоресценции определялось в процентах к стандарту флуоресценции в исследуемом диапазоне возбуждения.

Для анализа брали 10 мг липидов и растворяли в 6 мл спектрально чистого гексана. Для окисления липидных экстрактов добавляли в раствор 0.5 мг диоксида свинца (марки ЧДА) в виде кристаллического порошка. Смесь осторожно встряхивали и выдерживали в темноте при температуре +24°С в течение 60 мин до проведения спектрального анализа.

Влияния флуоресценции углеводородов при анализе природных флуоресцирующих продуктов исключали пропусканием исследуемых экстрактов липидов через колонку с активированной окисью алюминия. Липиды сорбировались на колонке, а углеводороды нет. Соответственно, спектры возбуждения флуоресценции липидов снимали до и после пропускания через колонку с окисью алюминия. Эта процедура позволила инструментально вычесть из общего значения флуоресценции флуорофоры углеводородов.

Анализ спектров возбуждения флуоресценции суммарных липидных экстрактов Mytilus galloprovincialis L. (гонады) (рис. 1) и Squalus achantias (печень) (рис. 2) показал, что после окисления диоксидом свинца в гексане появляются идентичные флуоресцирующие продукты с двумя максимумами: 306 нм и 321 нм.

Рис. 1.

Спектр возбуждения флуоресценции суммарных липидных экстрактов Mytilus galloprovincialis L. (гонады) до окисления (не окисл.) и после окисления (окисл.) диоксидом свинца в гексане.

Рис. 2.

Спектр возбуждения флуоресценции суммарных липидных экстрактов Squalus achantias (печень) до окисления (не окисл.) и после окисления (окисл.) диоксидом свинца в гексане.

Исходя из интенсивности флуоресценции экстрактов, имеющих одну исходную концентрацию исследуемого вещества, можно предположить, что в липидах Squalus achantias (печень) концентрация флуоресцирующего продукта выше примерно в четыре раза, чем в липидах Mytilus galloprovincialis L. (гонады).

Идентичность редокс-фрагментов стабильных парамагнитных центров [1] и флуорофоров с одинаковыми максимумами возбуждения флуоресценции (306 и 321 нм) в окисленных суммарных липидных экстрактах Mytilus galloprovincialis L. (гонады) и Squalus achantias (печень) может говорить о наличии близких по строению природных молекулярных структур с антиокислительной активностью.

Примененный методический подход к изучению флуоресценции исследуемых природных липидов с парамагнитными свойствами, учитывая высокую чувствительность этого метода, позволит использовать его при разработке оптимальной схемы выделения активного вещества для изучения его молекулярной структуры и функциональных свойств. Эти данные предполагается применить при создании бионического полупроводникового сенсора в качестве новой элементной базы для высокочувствительных магнитометров и гравиметров.