Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 423-426

В настоящее время ионные каналы являются перспективными терапевтическими мишенями для создания селективных лекарственных препаратов нового поколения. Выяснение механизмов их функционирования в норме и при патологии остается одной из актуальных задач биохимии, решение которой невозможно без использования соединений различной химической природы, способных специфически взаимодействовать с этими белками, и по возможности проявлять отличающиеся эффекты. Целенаправленный поиск новых лигандов ионных каналов как кандидатов для создания лекарственных препаратов представляет постоянный научный интерес, как для разработки методологии фундаментальных и прикладных исследований, так и для селекции наиболее безопасного и эффективного лекарственного средства.

Канал TRPV1 (transient receptor potential vanilloid type 1) является одним из важнейших интеграторов болевых и воспалительных стимулов и рассматривается как терапевтическая мишень в лечении болевых состояний разной этиологии. В организме млекопитающих он отвечает, прежде всего, за терморегуляцию и передачу болевых сигналов от периферии в мозг, и, как молекулярный сенсор, он распознает опасное нагревание выше 43°С, закисление внеклеточной среды и многочисленные агонисты различной природы [1].

Традиционные анальгетические средства по основному механизму своего действия либо подавляют воспалительные процессы, либо тормозят функционирование болевой (ноцицептивной) системы. Антагонисты TRPV1, блокируя важный рецептор и интегратор болевых стимулов на чувствительных нейронах, вызывают длительную анальгезию, поэтому их следует рассматривать как реальную альтернативу традиционным анальгезирующим средствам. К настоящему времени из природных источников выделено довольно много низкомолекулярных соединений и несколько пептидных лигандов к TRPV1, однако все они являются либо активаторами (капсаицин, резинифератоксин, VaTx1-3, DkTx, RhTx, BmP01), либо неполными ингибиторами (APHC1–APHC3, AG489) этого канала [2].

Ранее нами было установлено, что рекомбинантный аналог пептида HCRG21, ген которого был найден среди транскриптов, кодирующих пептиды Кунитц-типа морской анемоны Heteractis crispa, ингибирует сериновые протеазы: трипсин (константа ингибирования, K_i, 2.0 × 10^–7 M) и химотрипсин (K_i 7.0 × 10^–7 M) и блокирует на 95% индуцированные капсаицином токи, проходящие через экспрессированные в ооцитах лягушки каналы TRPV1 (IC₅₀ 6.9 ± 0.4 мкМ) [3]. Этот пептид обладает высокой структурной гомологией (до 95% идентичности) с выделенными из той же морской анемоны модуляторами TRPV1 – пептидами APHC1–APHC3 (рис. 1), которые проявляют анальгетический эффект в различных моделях стимуляции боли у лабораторных животных [4–9]. Пептиды APHC1–APHC3 и HCRG21 имеют характерную α + β укладку, стабилизированную тремя дисульфидными связями, так называемый BPTI/Кунитц-тип, впервые описанный для ингибитора сериновых протеаз из поджелудочной железы быка (BPTI – Bovine Pancreas Trypsin Inhibitor).

Рис. 1.

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей пептидов Кунитц-типа морской анемоны H. crispa, модуляторов TRPV1, и BPTI из Bos taurus. Выравнивание выполнено с помощью программы Vector NTI. Консервативные и подобные аминокислотные остатки (а.о.) выделены светлым оттенком серого цвета. Идентичные а.о. показаны на темно-сером фоне. Справа от последовательностей указан процент их идентичности относительно HCRG21.

Согласно данным молекулярного моделирования, пептиды APHC1 и HCRG21 имеют разные сайты связывания: APHC1 взаимодействует с TRPV1 в области внешней Р-петли [10], тогда как HCRG21 блокирует трансмембранную пору канала [3]. Блокирование поры и, как следствие, снижение проводимости ионного канала по другому механизму – является принципиально иным методическим подходом для купирования боли, несмотря на взаимодействие HCRG21 с той же молекулярной мишенью, что и APHC1.

Для изучения анальгетического эффекта мы получили рекомбинантные аналоги пептидов APHC1 и HCRG21 согласно разработанным ранее методикам [3, 11–14]. Для клонирования генов, кодирующих эти пептиды, использовали плазмиду pET32b. Пептиды получали в составе гибридного белка с тиоредоксином и полигистидиновой последовательностью для выделения целевых продуктов с помощью металл-аффинной хроматографии. Перед первым аминокислотным остатком пептидов был размещен остаток метионина для селективного расщепления гибридного белка и получения целевого продукта [15]. Обработанные бромцианом пептиды были очищены методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход целевых пептидов составил 2.0 и 5.5 мг/л культуральной среды для APHC1 и HCRG21 соответственно. Молекулярные массы полученных пептидов, по данным MALDI-TOF MS, соответствовали расчетным.

Эффективность обоих лигандов при внутримышечном способе введения была впервые оценена на животной модели “горячая пластина”, которая наиболее объективно отражает активацию канала TRPV1 теплом. Рекомбинантные пептиды в дозах от 0.01 до 1 мг/кг в объеме 0.07 мл вводили мышам линии ICR в латеральную мышцу левого бедра. Контрольным мышам вводили 1%-ный раствор PBS в том же объеме. После введения исследуемых веществ на 60-й мин животных помещали на горячую пластину Hot-Plate Analgesia Meter (Columbus Instruments, Columbus, OH, USA), заранее нагретую до 55°С. Фиксировали латентное время от момента помещения животного на горячую пластину до первого подпрыгивания. Максимальное время пребывания животного на пластине составляло 60 с.

Согласно полученным данным, анальгетическое действие пептидов в дозе 0.1 мг/кг одинаково достоверно отличалось от контроля, но время задержки времени первого подпрыгивания для модулятора APHC1 было больше. Таких же значений задержки для пептидного блокатора HCRG21 удалось добиться в дозе 0.5 мг/кг (рис. 2). При повышении дозы до 1 мг/кг наблюдалось незначительное снижение эффективности обоих пептидов.

Рис. 2.

Дозозависимое ингибирование термической ноцицепции пептидами APHC1 и HCRG21 (n = 6 для каждой группы). Результаты представлены в виде среднего значения ± s.e.; * – р <0.05, ** – р < 0.01, *** – p < 0.001 по сравнению с группой с PBS (тест Стьюдента).

Для сравнения эффективности анальгетического действия была изучена фармакодинамика исследуемых пептидов в том же тесте при внутримышечном введении в течение 24 ч в дозе 0.1 мг/кг.

Ярко-выраженное анальгетическое действие HCRG21 начало проявляться через час после введения и сохранялось в течение 13 ч (рис. 3). В отличие от HCRG21, пептид APHC1 быстро увеличивал время первого подпрыгивания (на 34% уже на 5-й мин), но уже к 3-м ч APHC1 не оказывал достоверного анальгетического эффекта. Это можно объяснить различием измеренных в экспериментах in vitro значений полумаксимального эффекта пептидов на проводимость капсаицин-индуцированных токов через TRPV1; так EC₅₀ для APHC1 составляло 54 нМ [12], а IC₅₀ для HCRG21 – 6.9 мкМ [3]. Более аффинный лиганд APHC1, связываясь прочнее, достигал более быстрого эффекта (максимальный эффект на 15-й мин), тогда как анальгетическое действие полного блокатора HCRG21 развивалось в течение 1 ч (максимальный эффект 2 часа), но оно было более пролонгированным. К 24-м ч эффекты обоих пептидов практически не отличались от контроля.

Рис. 3.

Динамика развития обезболивающего действия пептидов APHC1 и HCRG21 за 24 ч (n = 6 для каждой группы). Результаты представлены в виде среднего значения ± s.e.; * – р < 0.05, ** – р < 0.01, *** – p < 0.001 по сравнению с группой с PBS (тест Стьюдента).

Таким образом, в настоящем исследовании впервые была изучена анальгетическая активность пептида HCRG21 на животных в тесте тепловой чувствительности “горячая пластина”. Данные для APHC1 в подобных тестах были уже опубликованы, но не для внутримышечного способа введения. Результаты исследования объективно отражают потенциал обоих пептидов как хороших анальгетиков. С учетом разности измеренных ранее констант в экспериментах in vitro, результаты на животной модели частично подтверждают предположение, сделанное на основе результатов электрофизиологических измерений, что при практически полном блокировании ионного канала TRPV1 можно достичь более длительного анальгетического эффекта. В свою очередь более низкое значение ЕC₅₀ обусловливает быстрое развитие анальгетического эффекта. В итоге оба пептида удачно дополняют друг друга, и их комбинация в одном анальгетическом препарате, вероятно, приведет к очень быстрой и продолжительной анальгезии.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена в рамках проекта по гранту РНФ № 19-74-20088, авторы в работе использовали оборудование ЦКП ИБХ, поддержанного Минобрнауки России, идентификатор соглашения RFMEFI62117X0018.