Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 385-388

Одним из основных осложнений беременности и причин материнской и перинатальной смертности является преэклампсия, патология,

Список сокращений: dsРНК – двухцепочечная РНК, FDR – False Discovery Rate, уровень ложноположительных результатов, HIF – Hypoxia-Inducible Factor, индуцируемый гипоксией фактор. ДМСО – диметилсульфоксид, ФИТЦ – флуоресцеинизотиоцианат

патогенез которой связывают с нарушением маточно-плацентарного кровотока и развитием гипоксии плаценты и плода. По одной из теорий считается, что гипоксия плаценты является первичным фактором, ведущим к развитию заболевания: по-видимому, при гипоксии трофобласта в кровоток матери и ребенка могут выделяться различные эффекторные молекулы, запускающие патологические изменения [3, 4]. Одним из таких классов молекул могут являться микроРНК – короткие некодирующие РНК, осуществляющие регуляцию экспрессии генов на посттранскрипционном уровне [5]. Известно, что последовательность микроРНК не всегда является канонической: встречаются изоформы микроРНК, которые могут быть короче или длиннее канонической формы на несколько нуклеотидов с 3’- или 5’-конца последовательности, причем такие изменения могут существенно изменять регуляторные мишени молекулы [6]. При имитации гипоксии в клетках BeWo b30 было показано изменение профиля экспрессии изоформ микроРНК и их генов-мишеней в клетке [7], в том числе в клетках эндотелия [8], которые также являются неотъемлемой частью плацентарного барьера. Молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования изоформ микроРНК, практически не изучены.

Механизм созревания микроРНК состоит из нескольких последовательных этапов. Вначале в процессе транскрипции в ядре клетки образуется молекула при-микроРНК в форме шпильки. Далее происходит внутриядерный процессинг при-микроРНК, целью которого является удаление неспаренных концов молекулы; главную роль на этом этапе играет комплекс, состоящий из двухцепочечной РНК (dsРНК), специфической эндорибонуклеазы Drosha и белка, связывающего dsРНК, DGCR8 [9]. Полученная молекула пре-микроРНК далее транспортируется в цитоплазму белками XPO5/RAN-GTP, где проходит второй этап процессинга с помощью комплекса белков Dicer и TARBP2, которые приводят к отрезанию петли шпильки пре-микроРНК, в результате чего образуется РНК-дуплекс, далее распадающийся на две зрелые цепи микроРНК [10]. Известно, что работа комплексов Drosha/DGCR8 и Dicer/TARBP2 зачастую происходит со смещениями в позициях разрезания шпильки, что в конечном счете приводит к образованию различных изоформ микроРНК, нуклеотидные последовательности которых отличаются друг от друга в нескольких позициях на концах молекул [6]. Более того, на работу комплексов могут оказывать сильное влияние ряд других белков, что может приводить к изменению профиля изоформ микроРНК [11]. Так, семейства РНК-связывающих белков DDX5 и DDX17 выполняют роль посредника между комплексом Drosha/DGCR8 и белками SMAD, SRSF1, SNIP1, TP53, оказывающими стимулирующее влияние на внутриядерный процессинг микроРНК. Примером другого регуляторного механизма является работа белков LIN28, KHSRP, HNRNPA1 и PACT, контролирующих как внутриядерный, так и цитоплазматический процессинг ярко экспрессированного семейства микроРНК let-7.

Клеточная линия хориокарциномы человека BeWo, в частности ее клон BeWo b30, часто используется для моделирования плацентарного барьера in vitro, поскольку имитирует свойства клеток трофобласта. Данная клеточная модель позволяет изучать транспортную, барьерную, секреторную и другие функции плацентарного барьера и имитировать различные патологические состояния [1]. Так, с помощью производного оксихинолина, ингибирующего ферменты HIF-пролилгидроксилазы, возможна имитация гипоксии за счет накопления HIF-1α и регуляции экспрессии генов-мишеней, ассоциированных с ответом клетки на гипоксию [2].

Целью данного исследования являлось изучение изменения экспрессии белковых факторов, участвующих в процессе созревания микроРНК, при имитации гипоксии в клетках BeWo b30.

Клетки культивировали на полиэфирных проницаемых вставках Corning Transwell площадью 0.143 см² с размером пор 1.0 мкм. После достижения конфлюэнтности монослоя, которая контролировалась с помощью импедансной спектроскопии [12–14] и проницаемости для ФИТЦ-декстрана массой 70 кДа, клетки инкубировали в течение 24 ч в присутствии производного оксихинолина D014-0021 в концентрации 10 мкМ, как описано ранее [15]. Поскольку D014-0021 перед добавлением в культуральную среду растворяется в диметилсульфоксиде (ДМСО), то в контрольном эксперименте в среду добавлялся ДМСО до 2 об. %. После 24-часовой инкубации клетки лизировались в Qiazol Lysis Reagent для дальнейшего выделения РНК с помощью набора реагентов Qiagen miRNeasy Micro Kit. После этого производился полногеномный транскриптомный анализ с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0. Для поиска дифференциально представленных генов в клетках BeWo b30 в контрольных условиях и при имитации гипоксии был применен t-критерий Стьюдента с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественность сравнений путем расчета значений False Discovery Rate (FDR). Различия экспрессии генов считались достоверными при FDR-p < 0.05. Вероятности, связанные с анализом обогащения регуляторных путей, были рассчитаны с помощью метода Монте Карло с количеством повторов, равным 100000. В результате анализа литературы было определено 24 гена, кодирующих белки, которые принимают участие в процессе созревания микроРНК (табл. 1).

При сравнении результатов транскриптомного анализа образцов с гипоксией против контрольной группы было выявлено 7637 дифференциально экспрессированных генов из 25 683 возможных (FDR < 0.05). Из 24 генов, ассоциированных с процессингом микроРНК, экспрессия 17 статистически значимо различалась при гипоксии и в нормальных условиях (в табл. 2 представлены 6 генов с наибольшей разницей экспрессии). Дифференциально экспрессированными оказались гены DICER1 и DGCR8, что означает непосредственное изменение в деятельности комплексов, осуществляющих процессинг микроРНК. Более того, большинство РНК-связывающих белков, регулирующих деятельность комплексов Drosha/DGCR8 и Dicer/TARBP2, также оказались значимо дифференциально представленными на транскриптомном уровне. Для дополнительной валидации значимости найденных изменений, была оценена вероятность нахождения как минимум 17 генов со значимо измененным уровнем экспрессии при случайном выборе 24 из 25 683 транскриптов, экспрессия 7637 которых статистически значимо изменена. Вычисленная вероятность оказалась меньше 1.6 × 10^–5, что обосновывает неслучайность найденного обогащения списка генов.

Таким образом, было показано, что в модели плацентарного барьера на основе клеточной линии BeWo b30 при имитации гипоксии с помощью производного оксихинолина значимо изменяется уровень экспрессии большинства генов, кодирующих белки, которые вовлечены в молекулярный механизм процессинга микроРНК. Среди этих белков оказались как непосредственные ферменты-участники механизмов процессинга микроРНК, так и белки, косвенно регулирующие данный механизм путем воздействия на ключевых игроков. Данные результаты хорошо согласуются и дают теоретическое обоснование наблюдаемому при гипоксии изменению профиля экспрессии изоформ микроРНК.