Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 444-447

Эндоцитоз, механизм везикулярного транспорта различных молекул от плазматической мембраны эукариотических клеток в цитоплазму, участвует в широком спектре физиологических процессов [1]. В эукариотических клетках описано несколько различных путей эндоцитоза. Однако, несмотря на многолетнее изучение, множество деталей этого процесса остаются не выясненными [1]. Рибосом-инактивирующие белки второго типа (РИБ-II) являются классическим инструментом для выявления новых и более глубокого понимания уже известных путей внутриклеточного транспорта [1, 2]. К числу широко используемых РИБ-II относятся рицин и вискумин, которые обладают одинаковым механизмом действия и являются структурными гомологами [2–4], но цитотоксическая активность их значительно различается [5–8]. Оба белка состоят из двух цепей каталитической (А-цепи) и связывающей (В-цепи), соединенных дисульфидной связью. В-цепь связывается с гликозилированными белками и липидами, содержащими концевой остаток галактозы, на поверхности клетки. Часть связавшихся с мембраной молекул РИБ-II подвергается эндоцитозу в составе мембранных везикул и последующему ретроградному транспорту в эндоплазматический ретикулум, где происходит восстановление дисульфидной связи и транслокация А-цепи в цитоплазму. А-цепь является N-гликозидазой и необратимо модифицирует 28S РНК рибосом, что приводит к остановке белкового синтеза. Важной особенность работы с РИБ-II является возможность количественной оценки доли инактивированных в клетке рибосом с помощью ПРЦ-РВ [5].

Целью настоящего исследования было оценить роль аннексина 13 (ANXA13) во внутриклеточном транспорте везикул, содержащих рицин и вискумин. ANXA13 принадлежит к семейству мембраносвязывающих белков аннексинов, которые принимают участие в везикулярном внутриклеточном транспорте и является специфическим маркером клеток эпителия кишечника [9]. Недавно с помощью стабильного нокдауна гена белка внеклеточного матрикса α5 цепи ламининов нами была получена модификация клеточной линии колоректальной аденокарциномы НТ29 (HT29-mod) [10], в которой наблюдалось сниженная экспрессия ANXA13 как на уровне мРНК (в 9.3 и в 6.3 раза по данным микрочипов и ПЦР-РВ, соответственно), так и на уровне белка (в 30.6 раза) (рис. 1). Анализ экспрессии генов c помощью микрочипов проводили также, как описано в [11], с помощью ПЦР-РВ – как описано в [12], анализ протеома – как описано в [10].

Рис. 1.

Сравнение экспрессии ANXA13 в клеточных линиях HT29 и HT29-mod по данным микрочипов, ПЦР-РВ и протеома. * p < 0.05; ** p < 0.01.

Клетки обрабатывались рицином или вискумином в течение 1 ч. Затем проводилась замена культуральной среды на свежую, не содержащую РИБ-II. Оценку доли инактивированных рибосом проводили через 1 ч после замены среды с помощью ПРЦ-РВ по методу, разработанному нами ранее [5]. Приведем основные моменты, лежащие в основе этого метода: 1) А-цепь РИБ-II гидролизует N-гликозидную связь аденозина в положении A4324 α-сарцин-рициновой петли 28S рРНК, формирую АР-сайт; 2) обратная транскриптаза в процессе синтеза кДНК встраивает напротив АР-сайт аденин, в результате чего в последовательности происходит замена тимина на аденин; 3) используя специфические праймеры, 3'-конец которых комплементарен либо исходной либо модифицированной последовательности, можно детектировать накопление сигнала модифицированных 28S рРНК; 4) для нормирования используется сигнал накопления фрагмента 28S рРНК, удаленного от места модификации. Полученные результаты показали, что в клетках линии НТ29-mod при обработке вискумином для всех используемых концентраций через 2 ч детектировалось в 3–3.5 раза больше инактивированных рибосом по сравнению с исходной линией (табл. 1). Однако, при обработке клеток рицином доля инактивированных рибосом в клетках линии HT29-mod была, наоборот, ниже, как минимум в 3.6 раза, чем в исходной линии НТ29.

Одна из известных функций ANXA13 в клетках эпителия кишечника – участие в антероградном транспорте везикул от аппарата Гольджи к плазматической мембране. Полученные результаты свидетельствуют о том, что снижение экспрессии ANXA13 оказывает разнонаправленное влияние на действие вискумина и рицина. ANXA13 обладает предпочтением для связывания с участками мембраны обогащенными сфинголипидами и холестерином [9], это может определять специфичность транспорта внутриклеточных везикул, содержащих исследуемые РИБ-II [6, 13]. Аннексины, связываясь с мембраной, задают радиус кривизны образующихся везикул [9], что влияет на скорость их транспорта в цитоплазме [14]. Снижение экспрессии ANXA13 приводит к увеличению размера образующихся везикул и замедлению их транспорта. В случае вискумина, это приводит к снижению антероградного транспорта везикул и увеличению доли молекул токсина, достигших ЭПР и цитоплазмы.

В случае рицина ANXA13, по-видимому, играет минорную роль, в антероградном транспорте везикул, содержащих токсин, однако, может принимать участие в ретроградном транспорте. Изменение размера везикул, содержащих рицин, приводит к уменьшению долю молекул токсина, достигших ЭПР и цитоплазмы. Важно указать, что по данным протеома в клетках НТ29-mod также снижается экспрессия таких белков, вовлеченных в процесс внутриклеточного транспорта, как Rab1a, Rab21 и TMED2 (в 5.6, 4.4 и 11.5 раза соответственно). Нокдаун генов этих белков приводит к снижению чувствительности клеток к действию рицина [15]. Нами впервые показано, что в случае вискумина изменение экспрессии этих белков, по-видимому, играет минорную роль в транспорте везикул, содержащих токсин.

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод, что антероградный транспорт вискумина и рицина различается. Влияние ANXA13 на транспорт мембранных везикул связано как с его структурными (размер везикул), так и рецепторными свойствами (сортировка везикул). Снижение экспрессии ANXA13, по-видимому, замедляет антероградный транспорт везикул, содержащих вискумин, что и определяет увеличение доли инактивированных в клетках рибосом. В случае рицина, роль ANXA13 в антероградном транспорте представляется минорной. Участие ANXA13 в ретроградном транспорте везикул, содержащих рицин, требует дополнительных исследований. Нельзя также исключать, что снижение экспрессии ANXA13 приводит к компенсаторной активации альтернативного пути внутриклеточного транспорта везикул, который оказывается более специфичным для везикул, содержащих вискумин.