Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 453-457

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время разработка наносистем для тераностики опухолей является одной из наиболее быстро развивающихся областей биомедицины. При этом наиболее перспективными являются мультимодальные системы, которые могут быть платформой для различных способов визуализации – например, для магнитно-резонансной томографии (МРТ), компьютерной томографии (КТ) или позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)/однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) [1]. К числу таких мультимодальных платформ относятся апконвертирующие нанофосфоры, преимущества которых при использовании в качестве агента для тераностики активно обсуждаются в последние несколько лет [2–4].

В данной работе предлагаются НАФ, загруженные противоопухолевыми препаратами, в качестве агентов для тераностики солидных опухолей. Благодаря своей способности к антистоксовой люминесценции, НАФ хорошо подходят для использования в качестве биомаркеров при оптической визуализации патологий в глубине биологической ткани. В отличие от квантовых точек, НАФ менее токсичны и имеют стабильную узкополосную эмиссию при возбуждении в ближнем инфракрасном диапазоне. Ранее НАФ уже использовали для доставки различных противоопухолевых агентов, в том числе доксорубицина [5], куркумина [6] и цисплатина [7]. Однако, важным остается вопрос о роли функционализированной поверхности НАФ, которая должна способствовать накоплению препарата в опухолях и его контролируемому высвобождению [8]. В данной работе в качестве биодеградируемого биосовместимого покрытия предлагается полиэфир молочной кислоты (полилактид, ПЛА), который характеризуется низкой токсичностью и отсутствием воспалительной реакции in vivo. Целью данной работы была оценка эффективности модификации поверхности НАФ со структурой ядро/оболочка NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺/NaYF₄ с помощью ПЛА в присутствии различных стабилизаторов (декстран, поливиниловый спирт, поли-N-винилпирролидон) для загрузки и контролируемого высвобождения противоопухолевых препаратов на примере противоопухолевого антибиотика доксорубицина (DOX).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез НАФ на основе матрицы NaYF₄ проводили в соответствии с ранее описанным протоколом [9]. Продуктом синтеза были гидрофобные монодисперсные НАФ (75 ± 5 нм) со структурой ядро/оболочка (β-NaYF₄:18% Yb³⁺, 0.8% Tm³⁺/NaYF₄). Загрузка DOX проходила в две стадии. Сначала поверхность НАФ модифицировали с помощью ПЛА методом замены растворителя (НАФ диспергировали в хлороформе, смешивали с D, L-полилактидом (М_ср 18000-24000), смесь озвучивали и выдерживали при перемешивании в течение часа). Затем дисперсию НАФ при перемешивании и ультразвуковой обработке по каплям добавляли к 1 мл дистиллированной воды, содержащей стабилизаторы: декстран (Д), поливиниловый спирт (ПВС) или поли-N-винилпирролидон (ПВП). Полученные НАФ-ПЛА демонстрировали высокую коллоидную стабильность в водной среде. На втором этапе к НАФ-ПЛА, полученным в присутствии стабилизаторов, добавляли ацетон и вводили водный раствор DOX на 1 ч. При этом загрузка DOX составляла 0.089, 0.086 и 0.1 мг на 1 мг частиц для НАФ-Д (101 ± 9 нм), НАФ-ПВС (92 ± 7 нм) и НАФ-ПВП (85 ± 5 нм), соответственно (в скобках приведены размеры нанокомплексов в PBS рН 7.0). Спектрофотометрический анализ при длине волны 480 нм показал отсутствие DOX в надосадочной жидкости после трех циклов очистки, а также через неделю после получения образцов. Однако DOX может высвобождаться из таких частиц in vitro и in vivo путем ферментативной деструкции ПЛА. Схема модификации НАФ и загрузки DOX показана на рис. 1.

Рис. 1.

Схема модификации НАФ в присутствии ПЛА и последующая загрузка DOX. Спектр фотолюминесценции НАФ при длине волны возбуждения 975 нм и изображение НАФ, полученное методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Масштабный отрезок – 100 нм.

Возможность внутриклеточной визуализации НАФ была продемонстрирована с использованием эпилюминесцентного апконверсионного микроскопа (рис. 2). Было показано, что НАФ могут быстро (в течение 30 мин) связываться с мембранами клеток аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, при этом чувствительность метода позволяет детектировать в т.ч. сигнал одиночных НАФ, как это было показано ранее [10].

Рис. 2.

Антистоксовая фотолюминесцентная микроскопия, демонстрирующая локализацию НАФ в клетках аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3. Слева – люминесцентная фотография в апконверсионном канале детектирования, центр – фазовый контраст, справа – наложение двух фотографий.

Было показано, что НАФ, не загруженные противоопухолевыми препаратами, не вызывали значительной токсичности (24 ч) ни в модели опухолевых (глиома C6, U-87 MG), ни в культуре нормальных (макрофаги RAW 264.7) клеток во всем диапазоне исследованных концентраций (70–80% выживаемости при 0.2 мг/мл). При этом НАФ, загруженные DOX, демонстрировали значительную токсичность, и значения IC₅₀ на линии клеток глиомы крысы С6 после 24 ч инкубации составляли 0.09 ± 0.02 мг/мл, 0.04 ± 0.01 мг/мл и 0.03 ± 0.01 мг/мл для НАФ-Д, НАФ-ПВС и НАФ-ПВП соответственно. Было показано, что инкубация (16 ч) клеток глиобластомы человека U-87 MG с 0.05 мг/мл НАФ, загруженных DOX, приводила к развитию апоптоза, причем процент апоптотических клеток составлял ~10%, 20% и 30% для НАФ-Д, НАФ-ПВС и НАФ-ПВП соответственно. Уровень апоптоза оценивали с помощью окрашивания клеток флуоресцентным красителем Annexin V-FITC, позволяющего оценивать уровень фосфатидилсерина на поверхности клеток, что является маркером ранней стадии апоптоза. Это коррелировало с данными по цитотоксичности для каждого из вариантов модификации НАФ. Также было показано, что частицы НАФ-ПВП, загруженные DOX, накапливались в клетках (как в опухолевых U-87 MG и C6, так и в макрофагах RAW 264.7) более активно, чем НАФ-Д или НАФ-ПВС (рис. 3). Это коррелирует с данными по цитотоксичности и развитию апоптоза в U-87 MG клетках. При этом наибольший уровень накопления НАФ был показан для клеток человеческой глиобластомы U-87 MG, а наименьший – для макрофагов RAW 264.7. Это означает, что использованные типы покрытий могут понижать нецелевой захват наночастиц макрофагами по сравнению с опухолевыми клетками, что должно усиливать накопление наночастиц в опухолях.

Рис. 3.

Верхняя панель – накопление НАФ, загруженных DOX в клетках U-87 MG, C6 и RAW 264.7, 60 мин инкубации, проточная цитометрия. Нижняя панель – накопление НАФ, загруженных DOX, в клетках С6 после 1 ч и 24 ч инкубации. Флуоресцентная микроскопия, ядра клеток показаны синим (краситель Hoechst), доксорубицин – красным.

ВЫВОДЫ

Апконвертирующие нанофосфоры были предложены в качестве носителя для доставки противоопухолевых препаратов. Был разработан способ покрытия поверхности НАФ полилактидом в сочетании с различными стабилизаторами (декстран, поливиниловый спирт, поли-N-винилпирролидон) для повышения биосовместимости НАФ. Противоопухолевый препарат доксорубицин был загружен в оболочку НАФ, противоопухолевая активность такого комплекса была оценена in vitro. Было показано, что НАФ, модифицированные ПЛА в присутствии поли-N-винилпирролидона, показали наиболее высокий уровень накопления в опухолевых клетках и, как следствие, наиболее высокую токсичность. Разработанный комплекс НАФ-ПЛА-DOX может быть предложен как агент для тераностики солидных опухолей.