Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 458-462

Изучение биологической эффективности тяжелых заряженных частиц высоких энергий в области низких и средних доз является актуальным для решения проблем ядерной медицины и космической биологии, а также для понимания фундаментальных механизмов развития цито- и генотоксических эффектов. Основным преимуществом пучков протонов, как и других ускоренных частиц, на котором основано их применение в терапии опухолей, является специфика их дозового распределения: относительной низкой дозой на входе и наличием пика Брэгга – максимального энерговыделения в конце пробега частицы на заранее заданной глубине, непосредственно в опухоли, что позволяет не повреждать окружающие здоровые ткани [1]. Но наряду с возможностью точной локализации основной энергии излучения величина относительной биологической эффективности (ОБЭ) протонов ниже, чем, например, у ионов углерода, и находится в диапазоне 0.6–1.8 [1, 2]. Международной комиссией по радиационным единицам и измерениям (ICRU) для клинического применения протонов в настоящее время рекомендовано значение ОБЭ, равное 1.1 [3]. Эта величина основана на многочисленных данных, полученных при облучении in vitro культур нормальных и опухолевых клеток с помощью методов, чувствительность которых зачастую требует применения высоких доз облучения, и полученные результаты трудно интерпретировать и экстраполировать для практических задач протонной терапии (ПТ), чаще всего использующей при фракционированном облучении стандартные дозы конвенциальной радиотерапии 1.5–2 Гр. Использование методов молекулярной биологии в ряде работ по исследованию действия протонов продемонстрировало также, что часто реализация одинакового конечного биологического эффекта осуществляется за счет сложного взаимодействия многих факторов: первичных инициирующих повреждений, активации разных сигнальных путей и механизмов, способов взаимодействия частиц с живым веществом и реализаций этих событий в регистрируемый критерий [4]. Для того чтобы понять, как первичные реакции через разные сигнальные пути формируют не только клеточные, но и, что более актуально для практики, тканевые и организменные ответы, необходимы исследования, полученные при облучении животных in vivo.

В последние годы в мире и нашей стране появились центры ПТ, использующие новую технологию облучения тонким сканирующим пучком протонов, которая позволяет облучать мишени с субмиллиметровой точностью, улучшает 3D конформацию дозы и снижает вклад нейтронов. Это позволяет уменьшить интегральную лучевую нагрузку на тело пациента в сравнении с другими методами протонной и фотонной лучевой терапии, что напрямую связано с уменьшением риска осложнений и развития рецидивов [5].

Целью настоящей работы было исследование действия тонкого сканирующего протонного пучка (ТСПП) в пике Брэгга в диапазоне доз 0.1–1.5 Гр на индукцию цитогенетических повреждений в костном мозге, продукцию активных форм кислорода (АФК) в цельной крови и состояние лимфоидных органов при тотальном облучении мышей in vivo относительно рентгеновского излучения (РИ).

В работе использовали 2-месячных самцов белых нелинейных мышей популяции SHK (24–28 г), которые содержались в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН. Все манипуляции проводили согласно нормативно-правовым актам о порядке экспериментальной работы с использованием животных [6], а план экспериментов был одобрен Комиссией ИТЭБ РАН по биологической безопасности и биоэтике (протокол № 4 от 5.04.2018). Мышей облучали на протонном синхротроне “Прометеус” (ФТЦ ФИАН, Протвино Московской области). Анестезированные золетил-ксилазиновым наркозом мыши помещались в поле облучения с точностью позиционирования до 1 мм. Облучаемый объем тела мыши определяли по томограмме с помощью трехмерной программы планирования, в среднем он составлял 65.4 см³. Мышей облучали в пике Брэгга в диапазоне доз 0.1–1.5 Гр (число частиц 1.28 × 10⁹–1.97 × 10¹⁰) при мощности дозы 0.1–1 Гр/мин на расстоянии 75 см от источника облучения. Энергия протонов на выходе из ускорителя в режиме тонкого сканирующего пучка составляла 90–116 МэВ. Контролировали дозу клиническим дозиметром на основе алмазного детектора (ИФТП, Россия) и дозиметрической пленкой (EBT2, США). Мышей группы положительного контроля облучали рентгеновским излучением на установке РУТ (200 кВ, 2 кэВ/мкм, 1 Гр/мин) в тех же дозах и условиях (ЦКП “Источники излучения” ИБК, Пущино). В каждом эксперименте был контроль, учитывающий транспортировку, наркотизацию и имитацию облучения животных. В каждой группе было 5–14 мышей. Через 28 ч после облучения животных выводили из эксперимента методом декапитации и производили забор органов и тканей. Время 28 ч было определено экспериментально в наших предыдущих работах для регистрации максимального уровня хромосомных повреждений в эритроцитах костного мозга с учетом длительности стадий эритропоэза и радиационной задержки клеточного цикла [7]. Критерием уровня цитогенетических повреждений служил процент полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами (МЯ) в костном мозге бедренной кости мышей. У этих же животных определяли индекс массы тимуса и селезенки, как отношение абсолютного веса органа к среднему весу животного в группе. Уровень продукции АФК в цельной крови, полученной при декапитации, мышей измеряли методом люминол-зависимой, зимозан-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) с помощью 12-канального прибора CHEMILUM-12. Определяли значения светоплощади под кривой при спонтанной и индуцированной ХЛ (S_сп, S_инд), а также индекс активации как отношение S_инд/S_сп. Достоверность различий между группами оценивали с помощью непараметрического критерия U Манна–Уитни. Вероятность ошибки p < 0.05 считали достаточной для вывода о статистической значимости различий.

Было обнаружено (рис. 1), что уровень ПХЭ с МЯ в костном мозге при всех дозах протонного изучения был близок к РИ и коэффициент ОБЭ, вычисленный по равноэффективным дозам, равнялся 1.15. Величина ОБЭ оказалась близка к значениям, определенным в этом же диапазоне доз для протонных пучков других энергий и конфигураций, полученных на культурах клеток или другими методами [8, 9]. В большинстве работ этот коэффициент вычислен относительно гамма-излучения [5], поэтому с учетом ОБЭ рентгеновского излучения относительно гамма-излучения по критерию хромосомных нарушений, ОБЭ ТСПП может быть выше. Полученный показатель является важной характеристикой действия протонного пучка на стволовые клетки костного мозга и свидетельствует о высокой эффективности используемой технологии.

Рис. 1.

Дозовые зависимости индукции полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге мышей при облучении тонким сканирующим пучком протонов и рентгеновским излучением.

На рис. 2 видно, что при действии ТСПП уменьшение индекса массы тимуса начиналось уже при дозе 0.5 Гр по сравнению с РИ, при котором уменьшение массы органа происходило только при дозе 1.5 Гр. Индекс массы селезенки снижался при облучении ТСПП уже в дозе 0.1 Гр в отличие от РИ. Патофизиологическое действие протонов на лимфоидные органы при облучении мышей изучено менее детально, чем гамма- и рентгеновского излучений, и связь молекулярных механизмов с тканевыми эффектами до конца не выяснена. В работе [10] исследовали гистологическими и иммунохимическими методами тимус, селезенку и костный мозг при тотальном облучении мышей равноэквивалентными дозами гамма-излучения 1.1 и 7 Гр, а для протонов 1.0 и 6.4 Гр. Было продемонстрировано, что гамма-излучение и протоны запускают клеточную гибель в органоспецифической манере; кроме того протоны индуцируют больше повреждений ДНК, а профили экспрессии генов имеют уникальные паттерны в селезенке, но не в других органах. Индукция апоптоза также сильно варьировала в зависимости от дозы и ткани, а клеточная гибель в костном мозге была значительно ниже у облученных протонами животных.

Рис. 2.

Индексы массы тимуса (а) и селезенки (б) мышей, облученных тонким сканирующим пучком протонов в пике Брэгга и рентгеновским излучением в диапазоне доз 0.1–1.5 Гр (* – статистически значимые отличия относительно необлученного контроля; && – статистически значимые отличия относительно рентгеновского излучения (p < 0.05)).

Известно, что повышенный уровень АФК в организме является признаком окислительного стресса, который может привести к различным повреждениям. При исследовании спонтанной продукции АФК клетками крови мышей в отдаленные сроки после облучения (через 28 ч), когда регистрировались цитогенетические повреждения, не было обнаружено различий между исследуемыми видами облучения, но индекс активации у мышей, облученных протонами в дозах 0.1–1 Гр, был выше, чем при действии РИ, у которого этот показатель не отличался от необлученного контроля (рис. 3). Этот факт указывает на стимуляцию резервных возможностей нейтрофилов к генерации АФК при действии низких доз протонов, что свидетельствует о повышенном напряжении антиоксидантной системы. В работе [11] были получены похожие данные об индукции АФК в период до 24 ч после облучения в пике Брэгга протонами с энергией 250 МэВ в более высоких дозах в 1–10 Гр на культуре предшественников нервных клеток. Было показано, что уровень АФК увеличивается в 3 раза быстрее на 1 Гр дозы к 6 и 24 ч после облучения протонами по сравнению с РИ. Показано, что в ранние сроки после облучения РИ и протонами при облучении высокими дозами, регистрируются наиболее существенные различия не только в продукции АФК, но и увеличении скорости апоптоза, повышения количества двунитевых разрывов ДНК, экспрессии ключевых для радиочувствительности генов [5, 12], что запускает каскад событий, приводящих к гибели клеток, мутагенезу и канцерогенезу. Полученные нами данные указывают на участие антиоксидантной системы в формировании цитогенетических эффектов при облучении животных in vivо, начиная с очень малых доз облучения, а сохранение высокого индекса активации свидетельствует о влиянии АФК на отдаленные последствия.

Рис. 3.

Дозовая завиcимоcть индекса активации ХЛ в цельной кpови мышей при облучении тонким сканирующим пучком протонов и рентгеновским излучением (* – статистически значимые отличия относительно своего необлученного контроля; && – статистически значимые отличия относительно рентгена (p < 0.05)).

Таким образом, при тотальном облучении мышей ТСПП в пике Брэгга в диапазоне низких и средних доз была определена величина ОБЭ по критерию цитогенетических нарушений в эритроцитах костного мозга, равная 1.15; выявлены существенные различия в патофизиологическом действии на лимфоидные органы и индукцию АФК клетками крови по сравнению с действием РИ. Данные позволяют оценить дозовую нагрузку на органы и ткани системы кроветворения при облучении животных малыми и терапевтическими дозами протонов, а также демонстрируют возможности технологии ТСПП и систем планирования на первом отечественном протонном синхротроне “Прометеус”. Полученные результаты помогут оптимизировать, с учетом рассчитанного ОБЭ, планируемую дозу облучения, с большей точностью подходить к оценке поглощенных доз. Дальнейшие исследования на опухолевых моделях у животных будут способствовать развитию протонной терапии с использованием современной технологии ТСПП для разработки новых схем радиотерапии, в том числе гипофракционирования, что позволит повысить эффективность лечения и снизить риск отдаленных последствий.