1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 494, № 1, 2020

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 463-467

Холодовый стресс активирует экспрессию генов аппарата транскрипции хлоропластов у растений Arabidopsis thaliana

И. А. Бычков 1, *, Н. В. Кудрякова 1, член-корреспондент РАН Вл. В. Кузнецов 1, В. В. Кузнецов 1

1 Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук
Москва, Россия

* E-mail: Ivan.a.b@mail.ru

Поступила в редакцию 22.05.2020
После доработки 30.05.2020
Принята к публикации 30.05.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучены физиологические и молекулярные реакции растений Arabidopsis thaliana на холодовый стресс. Воздействие низкой положительной температуры (4°С, 5 суток) вызывало снижение физиологических функций и активности ряда фотосинтетических генов с одновременной интенсивной экспрессией гена холодового стресса COR15a, продукт которого защищает хлоропласты. Впервые показано, что на фоне общего торможения физиологических функций в условиях гипотермии наблюдается усиление экспрессии большинства генов аппарата транскрипции хлоропластов. Это, очевидно, является одним из компенсаторных механизмов адаптации, направленных на поддержание клеточного гомеостаза и сохранение физиологических функций в условиях гипотермии.

Ключевые слова: гипотермия, хлоропласты, аппарат транскрипции, адаптация

Низкие положительные температуры понижают интенсивность протекания физиологических процессов и нарушают функционирование регуляторных систем у растений. В отличие от многих других живых организмов растения обладают высоким адаптивным потенциалом. В случае умеренной гипотермии (2–4°C) холодоустойчивые растения, одним из которых является Arabidopsis thaliana, способны к формированию защитных систем и повышению толерантности, что позволяет им в дальнейшем выживать на фоне действия отрицательных температур [1]. В основе адаптации растений к гипотермии лежит активация генов холодового стресса COR (cold-responsive genes), которые регулируются транс-факторами, взаимодействующими с C-повторами CBF (C-repeat binding factors), и другими регуляторами транскрипции, индуцируемыми в ответ на понижение температуры. Быстрая экспрессия генов транскрипционных факторов обеспечивает изменение транскриптома и, как следствие, изменение клеточного метаболизма и физиологических функций.

Особое значение в условиях пониженной температуры имеет функционирование хлоропластов, так как сохранение фотосинтетической активности при гипотермии является необходимым условием для поддержания жизнедеятельности организма. Функционирование хлоропластов обеспечивается координированной экспрессией пластидных и ядерных генов, характер взаимодействия которых в условиях гипотермии практически не изучен. Это относится в первую очередь к регуляции транскрипции, в частности к функционированию транскрипционного аппарата пластид.

Важнейшим этапом регуляции экспрессии пластидного генома является транскрипция. В пластидах есть два типа РНК-полимераз: фермент бактериального типа PEP (Plastid Encoded Polymerase) и моносубъединичные РНК-полимеразы фагового типа NEP (Nuclear Encoded Polymerase) [2]. У двудольных растений NEP представлена двумя белками, которые поступают или в пластиды (RPOTp), или одновременно в митохондрии и пластиды (RPOTmp). Для функционирования PEP требуются сигма-факторы, которые обеспечивают правильное связывание РНК-полимераз с промоторами пластидных генов и инициацию их транскрипции. Кроме того, транскрипционный аппарат пластид включает и Ser/Thr-протеинкиназу (сpCK2), которая, в зависимости от редокс-состояния компонентов электронотранспортной цепи хлоропласта, фосфорилирует субъединицы РЕР и сигма-факторы. В условиях освещения с комплексом PEP также ассоциированы 12 дополнительных PAP белков (PEP – associated proteins) [3]. За исключением коровых субъединиц РЕР, ключевые белки аппарата транскрипции пластид кодируются ядерными генами.

Целью настоящей работы было изучение влияния гипотермического стресса на экспрессию генов аппарата транскрипции растений Arabidopsis thaliana. Впервые было показано, что, несмотря на падение активности экспрессии фотосинтетических генов, адаптация к пониженным температурам сопровождается усилением интенсивности экспрессии большинства изученных нами генов компонентов аппарата транскрипции пластид.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали растения Arabidopsis thaliana экотипа Columbia 0. Семена высевали в чашки Петри на агаризованную (0.5%) питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) с половинной концентрацией минеральных солей. После холодовой стратификации семян (4°С, 2 суток) растения выращивали две недели в камере фитотрона при 22°C, интенсивности освещения 75 μE m–2 s–1 и продолжительности светового периода 16 ч. Затем их переносили на бумажные фильтры, смоченные жидкой МС-средой, и либо оставляли в камере фитотрона (контроль) при 22°C, либо помещали в климатическую камеру MLR-352Н-PE (Sanyo, Япония) на пять суток при 4°C. Условия освещения не изменялись.

Для оценки физиологического состояния проростков определены следующие показатели. Содержание хлорофиллов измеряли по методу Lichtenthaler [4]. Оценку содержания малонового диальдегида проводили по методу Heath и Packer [5]. Измерение пролина проводили по методу Bates с соавторами [6]. Выход электролитов оценивали согласно Campos с соавторами [7]. Максимальный потенциальный квантовый выход фотосистемы II (Fv/Fm) измеряли с помощью флуориметра DUAL-PAM-100 (Walz, Германия), как описано у Козулевой с соавторами [8]. Относительный уровень транскриптов генов оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-PCR) после обратной транскрипции с использованием готовой реакционной смеси, содержащей флуоресцентный краситель SYBR Green I (“Евроген”, Россия) на приборе LightCycler 96 (Roche, Швейцария). По окончании амплификации для подтверждения специфичности праймеров проводили процедуру плавления [9].

Информация о последовательности праймеров к изучаемым генам приведена в табл. 3. Все эксперименты проводились не менее чем в 3-кратной повторности. Статистическая обработка проводилась согласно критерию Стьюдента (t-test) [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Растения арабидопсиса в условиях гипотермии (4°С, 5 суток) испытывали состояние стресса. Об этом свидетельствует развитие окислительного стресса, показателем которого является увеличение уровня малонового диальдегида и усиление выхода электролитов из тканей, что свидетельствует о нарушении целостности клеточных мембран (табл. 1). Кроме того, понижались фотосинтетические показатели, в частности, уменьшалось содержание хлорофиллов, и падала фотохимическая активность фотосистемы II, о чем свидетельствовало снижение показателя максимального потенциального квантового выхода (Fv/Fm). Параллельно снижался уровень транскриптов ряда хлоропластных и ядерных генов, участвующих в фотосинтетических процессах (табл. 2). В том числе уменьшалось содержание транскриптов ядерных генов CAB2 и LHCB2, продукты которых участвуют в функционировании светособирающего комплекса второй фотосистемы. Примерно в два раза снижалась экспрессия пластидных генов, кодирующих структурные белки первой и второй фотосистем – psaB и psbD, соответственно, и гена большой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (rbcL) – фермента цикла Кальвина. Таким образом, наряду с окислительным повреждением клеток гипотермия вызывала значительное снижение эффективности фотосинтеза, вероятно, за счет ингибирования экспрессии фотосинтетических генов.

Таблица 1.

Изменение физиологических показателей у двухнедельных растений A. thaliana, выращенных при 22°C и подвергнутых гипотермии в течение 5 суток. Звездочками обозначены статистически достоверные различия между контрольными и опытными образцами согласно критерию Стьюдента (* – p < 0.05, ** – p < 0.01)

Измеряемые показатели Температурный режим
22°C 4°C
Хлорофиллы (a+b), мг/г сырой массы 1.029 ± 0.039 0.905 ± 0.015*
Fv/Fm 0.827 ± 0.009 0.698 ± 0.014**
Выход электролитов, % 16.2 ± 1.8 25.0 ± 2.1*
Содержание МДА, мкМ/г сырой массы 2.157 ± 0.087 3.116 ± 0.083**
Содержание пролина, мМ/г сырой массы 0.480 ± 0.051 0.983 ± 0.092**
Таблица 2.

Изменение уровня транскриптов хлоропластных и ядерных генов у двухнедельных растений A. thaliana, выращенных при 22°C и подвергнутых гипотермии в течение 5 суток. Значения нормированы относительно контроля. Звездочками обозначены статистически достоверные различия между контрольными и опытными образцами согласно критерию Стьюдента (* – p < 0.05, ** – p < 0.01)

Гены Температурный режим
22°C 4°C
RPOTp 1.000 ± 0.045 4.709 ± 0.314**
RPOTmp 1.000 ± 0.051 9.145 ± 0.412**
cpCK2 1.000 ± 0.069 1.785 ± 0.122*
PAP1 1.000 ± 0.104 2.447 ± 0.220*
PAP2 1.000 ± 0.053 2.274 ± 0.115**
PAP3 1.000 ± 0.073 6.014 ± 0.219**
PAP4 1.000 ± 0.054 7.615 ± 0.411**
PAP5 1.000 ± 0.038 4.936 ± 0.147**
PAP6 1.000 ± 0.044 5.647 ± 0.356**
PAP7 1.000 ± 0.039 2.695 ± 0.079**
PAP8 1.000 ± 0.057 4.742 ± 0.241**
PAP9 1.000 ± 0.089 11.360 ± 0.710**
PAP10 1.000 ± 0.053 4.613 ± 0.215**
PAP11 1.000 ± 0.049 3.952 ± 0.301**
PAP12 1.000 ± 0.056 3.019 ± 0.107**
SIG1 1.000 ± 0.128 2.479 ± 0.315*
SIG2 1.000 ± 0.048 1.853 ± 0.057**
SIG3 1.000 ± 0.069 1.050 ± 0.071
SIG4 1.000 ± 0.064 0.827 ± 0.053
SIG5 1.000 ± 0.044 3.256 ± 0.311
SIG6 1.000 ± 0.093 2.428 ± 0.185*
rpoA 1.000 ± 0.051 1.489 ± 0.069*
rpoB 1.000 ± 0.041 1.687 ± 0.073*
rbcL 1.000 ± 0.077 0.451 ± 0.028*
psbD 1.000 ± 0.042 0.410 ± 0.019**
psaB 1.000 ± 0.056 0.497 ± 0.025*
LHCB2 1.000 ± 0.047 0.111 ± 0.009**
CAB2 1.000 ± 0.073 0.349 ± 0.024*
COR15a 1.000 ± 0.045 83.011 ± 3.134**
Таблица 3.

Праймеры, использованные для количественного анализа ПЦР в реальном времени

Ген Локус Прямой праймер (5'-3') Обратный праймер (3'-5')
RPOTp At2g24120 ttgctgctgcttgctattctgc gcacaatcaccaagccaact
RPOTmp At5g15700 cgtttcctcatttagactttcctc ccttctctctgtctgcgtctctgt
cpCK2 AT2G23070 tcttttatggccatgacaact ctgttggcctttcttggt
PAP1 At3g04260 tgagagtggtggagagattacgga ccatcttgcttgctgctttcg
PAP2 At1g74850 cggggacagttggagaaaagc gacctccattccatcccgtga
PAP3 At3g48500 ggaaaggcaatgtgtggtatga aagaggttgctgttccgagtaa
PAP4 A45g23310 atcaaggctacatacaacaacggga aaccaaaatccttatcaatctgctcaa
PAP5 At2g34640 atgcggttatggatttcagag ttctcttttgtcagtagtgcttcat
PAP6 At3g54090 ggcggagactgtgaaagaacca gtattgccgtaaaaagagttgattgc
PAP7 At4g20130 tatgggcggttagtatggcacag cagcatttgacataacctccagca
PAP8 At1g21600 cactgaaccacctattgatgccc gaactctggctctggtgattgactt
PAP9 At5g5110 gcagtaaatccgctcgtatggg catcttctgtctctgttccttcttgttct
PAP10 At3g06730 aggtgccgttgattgttgat ggactgatgaagaataatgtaggtaac
PAP11 At5G63680 cgttgtgctgttgctatgggtg tgcttcccgacattcctctctg
PAP12 At5G24314 agagagatgataatggacgccg tgtcattaccttcccaacttctctt
SIG1 At1G64860 cattgcggatactcgtttgg cccgttctccgagtgttgc
SIG2 At1G08540 tcttcttcgtcttcatcatccgc ctgctgctgctacaactactgctt
SIG3 At3G53920 ggaggtcgagtggacagct ttctctccatgtccgccact
SIG4 At5G13730 tcacgaggattcagagaggta gctatcaaccactctatccactg
SIG5 At5g24120 agatgttgatggtgttggagc gactctctttcggcttcaatg
SIG6 At2g36990 tcgcctattgttggttcgc gggctgataatgatgatgcg
rpoA ArthCp055 cgccaagtaaagctcttcgc aaggccaagccgacacaata
rpoB ArthCp014 atgagcaacaccaaacccct gggtaggcgaaatggaggtt
rbcL AtCg00490 cgggtacatgcgaagaaatga tctcggtcaaagcaggcata
psbD AtCg00270 ggatgactggttacggaggg ggttgtacctgtgaaccaacc
psaB AtCg00340 ctcaggaccccactactcgt ttgcccgaaatgagaagc
LHCB2 AT3G27690 ccaacgatctcctccgcaaa agacttgacggtacgacgca
CAB2 At1G29920 tcaagtttggagaggcagttt gtaaccttcaacggctcccat
COR15a AT2G42540 aacgaggccacaaagaaagc cagcttctttacccaatgtatctgc
UBQ At4G05320 gcgtcttcgtggtggtttctaa gaaagagataacaggaacggaaaca

В ответ на холодовое повреждение растений наблюдалась активация молекулярных механизмов, направленных на стабилизацию клеточного метаболизма и сохранение физиологических функций в условиях гипотермии. Прежде всего, повышался уровень экспрессии гена COR15a, продукт которого защищает белки стромы от агрегации, тем самым повышая устойчивость хлоропластов (табл. 2) [11]. Более чем в два раза возрастало содержание пролина – универсального стресс-протекторного соединения, проявляющего свойства химического шаперона и антиоксиданта (табл. 1).

Особый интерес вызывает тот факт, что, одновременно с падением уровня экспрессии пластидных фотосинтетических генов, процесс адаптации к холоду сопровождался повышением активности большинства генов аппарата транскрипции хлоропластов (табл. 2). Параллельно с некоторым ростом экспрессии генов rpoА и rpoB, кодирующих α- и β-субъединицы PEP, наблюдалась активация генов обеих полимераз NEP и всех PAP-белков, а также гена сpCK2 и трех из шести генов сигма-факторов: SIG1, SIG2, SIG6.

Индуцированные в условиях гипотермии гены сигма-факторов непосредственно связаны с процессами фотосинтеза. Так, SIG2 и SIG6 участвуют в регуляции синтеза хлорофилла, а SIG5 непосредственно участвует в транскрипции psbD гена, кроме того, SIG2 вовлечен в светозависимую координацию передачи сигналов от пластиды к ядру [12]. SIG1 принимает участие в обеспечении электронного транспорта в фотосистемах, который существенно снижается под воздействием холода, что приводит к накоплению АФК и вызывает окислительное повреждение клеток [13]. Примечательно, что белки PAP, гены которых активировались при гипотермии (PAP3, 4, 6, 9, 10) в наибольшей степени, участвуют в защите клеточных мембран от активных форм кислорода, что также может свидетельствовать об адаптационной направленности экспрессии изучаемых генов.

Воздействие холода замедляет большинство процессов роста и развития растений, снижая, в том числе, расход энергии [14]. Сохранение фотосинтетической активности при гипотермии является критически важным для поддержания жизнедеятельности организма. При этом падение активности фотосинтетических генов и одновременное усиление экспрессии генов аппарата транскрипции на фоне гипотермии может объясняться своего рода “балансированием” между энергозатратными реакциями адаптации и поддержанием фотосинтетической функции при общем снижении метаболических процессов. Функционирование пластид и митохондрий в условиях гипотермии сопровождалось ростом экспрессии генов NEP, что, возможно, связано со способностью этих полимераз, функционирующих на ранних этапах онтогенеза, активироваться стресс-зависимым путем у взрослых растений [15] и обеспечивать тем самым повышение уровней транскрипции генов “домашнего хозяйства”. Анализ in silico промоторных областей генов NEP полимераз с помощью программного онлайн ресурса AthaMap позволяет предположить наличие в них сaйтов связывания целого ряда транс-факторов, непосредственно индуцируемых гипотермией или активируемых CBF [16]. В пределах последовательности в 500 п.н., в направлении 5'-конца от стартового кодона ATG, которая составляет эффективную длину промотора для большинства генов Arabidopsis, были идентифицированы цис-элементы для таких транс-факторов как ATH12, CBF, MYB111, RAP2.6, RAV1, WRKY18, ZAT6. Все эти транс-факторы активируют транскрипцию генов COR в ответ на падение температуры [17]. Цис-элементы для индуцируемых холодом транс-факторов присутствовали и в промоторах ряда других генов, кодирующих аппарат транскрипции пластид. Однако для получения доказательств их прямого участия в реакциях адаптации необходимо подтвердить взаимодействие транс-факторов с цис-элементами промоторных областей этих генов in vivo.

Таким образом, гипотермия вызывала развитие стресса у растений, что проявлялось в усилении окислительного стресса, повреждении целостности клеточных мембран, ингибировании большой группы фотосинтетических генов и снижении фотохимической активности фотосистемы II. Одновременно активировались защитные системы, такие, как аккумуляция стресс-протекторных соединений (пролин) и многократная активация экспрессии COR15a гена, обеспечивающего защиту хлоропластов при гипотермии. Процесс адаптации растений к холоду сопровождался повышением активности большинства генов аппарата транскрипции хлоропластов (rpoА и rpoB, генов обеих полимераз NEP, PAP-белков, сpCK2, SIG1, SIG2, SIG5, SIG6). Отдельные компоненты аппарата транскрипции принимают непосредственное участие в стресс-протекторных реак-циях и поддержании процесса фотосинтеза на минимально-необходимом уровне. Подобная активация генов транскрипционного аппарата хлоропластов может рассматриваться как компенсаторный механизм адаптации, направленный на поддержание клеточного гомеостаза и сохранение физиологических функций в условиях гипотермии. Нельзя также исключать, что наблюдаемая активация генов транскрипционного аппарата может повышать жизнеспособность растений на этапе восстановления растений после перенесенного стресса.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы утверждают об отсутствии конфликтов интересов.

Список литературы

  1. Yadav S.K. // Agron. Sustain. Dev. 2010. V. 30. P. 515–527. https://doi.org/10.1051/agro/2009050

  2. Kusnetsov V.V. // Russ. J. Plant Physiol. 2018. V. 65. P. 465–476. https://doi.org/10.1134/S1021443718030044

  3. Pfannschmidt T., Blanvillain R., Merendino L., et al. // J. Exp. Bot. 2015. V. 66. P. 6957–6973. https://doi.org/10.1093/jxb/erv415

  4. Lichtenthaler H.K. // Meth. Enzymol. 1987. V. 148. P. 350–382. https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)48036-1

  5. Heath L.R., Packer L. // Arch. Biochem. Biophys. 1968. V. 125. P. 189–198. https://doi.org/10.1016/0003-9861(68)90654-1

  6. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. // Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205–207. https://doi.org/10.1007/BF00018060

  7. Campos P.S., Quartin V., Ramalho J.C. et al. // J. Plant Physiol. 2003. V. 160. P. 283–292. https://doi.org/10.1078/0176-1617-00833

  8. Kozuleva M. A., Lysenko E. A., Klaus A. A. et al. // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2017. V. 472. P. 71–73. https://doi.org/10.1134/S1607672917010215

  9. Danilova M.N., Kudryakova N.V., Voronin P.Yu. et al. // Russ. J. Plant Physiol. 2014. V. 61. P. 434–442. https://doi.org/10.1134/S1021443714040062

  10. Student // Biometrika. 1908. V. 6. P. 1–25. https://doi.org/10.1093/biomet/6.1.1

  11. Thalhammer A., Bryant G., Sulpice1 R. et al. // Plant Physiology. 2014. V. 166. P. 190–201. https://doi.org/10.1104/pp.114.245399

  12. Mochizuki N., Brusslan J.A., Larkin R. // Plant Biology. 2001. V. 98. № 4. P. 2053–2058. https://doi.org/10.1073/pnas.98.4.2053

  13. Zhao Y., Han Q., Ding C. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. 1390. https://doi.org/10.3390/ijms21041390

  14. Armstrong A.F., Wardlaw K.D., Atkin O.K. // Plant Cell Environ. 2007. V. 30. № 12. P. 1513–1522. https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2007.01738.x

  15. Lerbs-Mache S. // Plant Mol. Biol. 2011. V. 76. P. 235–249. https://doi.org/10.1007/s11103-010-9714-4

  16. Steffens N.O, Galuschka Schindler M., et al. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 368–372. https://doi.org/10.1093/nar/gkh017

  17. Park S., Lee C.M., Doherty C.J. et al. // Plant J. 2015. V. 82. P. 193–207. https://doi.org/10.1111/tpj.12796

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал