Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 504-507

Исследование механизмов деструкции раковых клеток является сегодня предметом повышенного внимания в связи с необходимостью изобретения эффективных антиопухолевых индукторов [1–7]. Aсцитная карцинома Эрлиха мыши (АКЭ) обладает относительно высокой чувствительностью к терапевтическому воздействию, что делает ее удобной моделью для изучения различных аспектов программированной гибели [8–10]. В результате исследования деструкции клеток, находящихся в одинаковых культуральных условиях монослойной АКЭ, выявлены как апоптоз, так и некроз [11]. Кроме того, обнаружен третий паттерн клеточной гибели, соответствующий морфологической модели апоптотического некроза [12]. Показано, что сдвиг в сторону некроза может быть достигнут при использовании антиопухолевого индуктора кукумариозид А₂-2 [12], применение которого активизирует цитоплазматический и ядерный автолиз, происходящий при активной экспрессии калпаина и каспазы-1 [7].

В результате данной работы, выполненной на клетках АКЭ в условиях имитации голодания, установлено, что разрушение клеток может также происходить ранее неизвестным способом, при котором постепенное слияние вакуолизированных митохондрий приводит к разрыву клеточной мембраны и выходу клеточного ядра в межклеточное пространство. Этот вариант клеточной гибели трактуется нами как ранее неизвестная разновидность митоптоза, которую мы условно характеризуем как “катастрофический митоптоз”. Выявление митоптоза, функционирующего в АКЭ наряду с другими типами деструкции, дополняет представление о полиморфности механизмов клеточной гибели в АКЭ. Наличие в АКЭ морфологически разных деструктивных вариантов позволяет сделать предположение о физиологической неоднородности клеток, предопределяющей “выбор” способа самоуничтожения, и ставит вопрос о необходимости создания комплексных индукторов, способных к активации всех возможных вариантов деструкции, функционирующей в опухолях.

В экспериментах использовали музейный тетраплоидный штамм клеток мышиной АКЭ, полученный из “НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина” Минздрава России (Москва). Клетки АКЭ пассировали в брюшной полости белых беспородных мышей обоего пола весом 18–20 г. Для эксперимента клетки отбирали на 7–10 день после инокуляции опухоли. Для этого мышей забивали методом перивисцеральной дислокации и с помощью шприца собирали асцитическую жидкость, содержащую опухолевые клетки. Клетки дважды отмывали от экссудата центрифугированием при 1500 об/мин (450 g) в течение 10 мин на центрифуге Heraus Labofuge 400R (Германия) в фосфатно-солевом буферном растворе.

Клетки в концентрации 2–5 × 10⁶ клеток/мл помещали в 24-луночные планшеты и инкубировали в культуральной среде DMEM, содержащей L-глютамин (2 мМ), FCS (10%) и гентамицин (100 мкг/мл) в CO₂-инкубаторе при 37°С в течение 24 ч. Для индукции клеточной деструкции, вызванной голоданием, клетки инкубировали в обедненной среде, состоящей только из фосфатно-солевого буферного раствора и не содержащего сыворотку и L-глютамин. Через 24 ч суспензию клеток отбирали, переносили в пробирки типа эппендорф и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин (400 g) в течение 5 мин.

Для микроскопического анализа клетки фиксировали в 2.5%-м глютаральдегиде на 0.1М какодилатном буфере. После фиксации клетки поместили в 1X PBS. Для изучения клеточной суспензии методом фазово-контрастной микроскопии использовали микроскоп Zeiss Axiovert 200M Apotome (Германия). Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии суспензию клеток помещали на поверхность покровных стекол Thermanox^® Plastic Coverslips (США), выдерживали до их оседания 30 мин и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне. После этого образцы окончательно высушивали в диоксиде углерода по методике сушки в критической точке, используя прибор фирмы BAL-TEC (critical point dryer 030, Германия), помещали на поверхность алюминиевых столиков и напыляли углеродом. Анализировали образцы на сканирующем электронном микроскопе Zeiss EVO 40 (Германия). Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии клеточную суспензию дофиксировали в 2%-м растворе OsO₄ на 0.1М какодилатном буфере. После обезвоживания в спиртах и ацетоне материал заключали в Аралдит. Ультратонкие срезы толщиной 80 нм получали с использованием ультрамикротома Ultracut Leica UC6 (Германия) и помещали на медные бленды, покрытые формваровой подложкой. Срезы окрашивали растворами уранилацетата и цитрата свинца и изучали в электронном микроскопе Zeiss Libra 120 (Германия).

В результате исследования установлено, что в условиях бедного питания значительная часть клеток АКЭ погибает ранее неизвестным способом. Показано, что происходит модификация митохондрий; эти органеллы увеличиваются в размере и утрачивают большую часть митохондриальных крист, которые формируют закрученные мембранные конгломераты, расположенные в центре митохондрий. Такие митохондрии имеют электронно-светлое содержимое, напоминая этим вакуоли (рис. 1а). По-видимому, вакуолизация митохондрий происходит благодаря автолизу содержимого этих органелл. Вакуолизированные митохондрии образуют скопления и контактируют друг с другом (рис. 1б). На поздней стадии деструкции часть сливающихся митохондрий локализована около клеточной мембраны, в которой возникает отверстие, формируемое благодаря сливанию мембраны одной из вакуолизированных митохондрий и клеточной мембраны (рис. 1в). Некоторые вакуолизированные митохондрии контактируют с клеточным ядром (рис. 1г). Благодаря сливанию вакуолизированных митохондрий вокруг клеточного ядра формируется полость, а также происходит расширение отверстия в клеточной мембране (рис. 1д). Установлено, что благодаря наличию отверстия в клеточной мембране происходит выброс клеточного ядра через это отверстие (рис. 1е, ж). В результате появляются клетки, имеющие отверстие, через которое ранее произошел выброс ядра (рис. 1з, и).

Рис. 1.

Клетки асцитной карциномы Эрлиха, подвергающиеся катастрофическому митоптозу. (а) – начальная стадия вакуолизации митохондрий; органеллы увеличиваются в размере и утрачивают большую часть митохондриальных крист (МК), которые формируют закрученные мембранные конгломераты, расположенные в центре митохондрий (показаны стрелками), трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ), масштаб 0.5 мкм; (б) – прогрессирующая стадия вакуолизации митохондрий; вакуолизированные митохондрии формируют скопления и контактируют друг с другом, ТЭМ, масштаб 0.5 мкм; (в) – прогрессирующая стадия вакуолизации митохондрий; появление соединительных каналов между вакуолизированными митохондриями (показаны окружностями) и отверстия в клеточной мембране (показано наконечником стрелки), формируемого благодаря сливанию мембраны одной из вакуолизированных митохондрий и клеточной мембраны, ТЭМ, масштаб 0.5 мкм; (г) – прогрессирующая стадия вакуолизации митохондрий; вакуолизированные митохондрии, контактируют с клеточным ядром (Я) (место контакта показано окружностью), ТЭМ, масштаб 0.5 мкм; (д) – завершающая стадия вакуолизации митохондрий; благодаря сливанию вакуолизированных митохондрий около ядра (Я) формируется околоядерная полость (показана звездочками), а также происходит расширение отверстия в клеточной мембране (показано наконечниками стрелки), ТЭМ, масштаб 0.5 мкм; (е) – выброс ядра (ядро показано стрелкой) через разрыв клеточной мембраны, фазово-контрастная микроскопия (ФКМ), масштаб 1 мкм; (ж) – выброс ядра (ядро показано стрелкой) через разрыв клеточной мембраны, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), масштаб 1 мкм; (з) – погибающая клетка, имеющая разрыв (указан окружностью), через который ранее произошел выброс ядра; СЭМ, масштаб 1 мкм; (и) – погибающая клетка, имеющая разрыв (указан окружностью), через который ранее произошел выброс ядра, ФКМ, масштаб 1 мкм.

Как показали наши исследования, гибель клеток АКЭ происходит в результате трансформации митохондрий, и этот способ, по-видимому, можно считать разновидностью митоптоза. Согласно литературным данным, при митоптозе происходит разрушение внутренней митохондриальной структуры при сохранении целостности внешней мембраны. В определенных состояниях разрушается внешняя митохондриальная мембрана, а внутренняя структура какое-то время сохраняет целостность. Известно, что деградировавшие митохондрии либо утилизируются автофагосомами, либо высвобождаются из клетки в виде митоптических тел [13–15].

Митоптоз в АКЭ – это прогрессирующее сливание автолизирующихся митохондрий, формирующих единую внутриклеточную полость, через которую происходит эвакуация клеточного ядра в межклеточное пространство. Необходимо отметить, что данный способ митоптоза не был описан ранее ни для клеток АКЭ, ни для других типов опухолевых клеток. По нашему мнению, данный вариант митохондриальной деструкции, который мы предлагаем условно охарактеризовать как “катастрофический митоптоз”, может дополнить список уже известных разновидностей митоптоза. Учитывая ярко выраженный травматический характер данного процесса, приводящего к тотальному коллапсу клетки, поиск подходов к его стимуляции является перспективной задачей при разработке стратегии борьбы с канцерогенезом.