Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 495, № 1, стр. 598-601

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служили образцы опухолей 36 женщин в возрасте от 48.0 до 62.8 лет с инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа. От каждой опухоли брали по два образца объемом 8 мм³, один из которых помещали в культуральный флакон с 1 мл питательной среды DMEM-F12, содержащей 20 мкг/мл HLDF (предоставленного Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) [8], другой, контрольный, – в питательную среду без HLDF. Больным, образцы опухоли которых использовались в исследовании, до операции не проводили никакого лечения.

После инкубации при 37°С в течение 72 ч образцы опухолей извлекали из среды и фиксировали в 10% растворе формалина. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые окрашивали гематоксилином Гаррисона и эозином. Морфометрический анализ осуществлялся на базе микроскопа Микмед-6, цифровой камеры DCM510 и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США).

Исследование проводилось двумя независимыми патоморфологами, которые не были информированы о том, какие образцы опухоли были инкубированы с HLDF. Для каждого образца опухоли морфологические признаки оценивали по 8 микрофотографиям (площадь каждой – 95 578 мкм²), суммарная тестируемая площадь составила 764 624 мкм². Определение степени дифференцировки клеток проводилось на основании анализа клеточного и ядерного полиморфизма и способности клеток к структурообразованию [6, 7].

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного пакета для статистической обработки SPSS v 17.0 for Windows. Для сравнения зависимых групп применяли критерий Вилкоксона. Различия между значениями сравниваемых параметров расценивали как статистически значимые при р < 0.05. Полученные в ходе исследования данные представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q₁; Q₃).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Контрольные образцы опухолей, культивирование которых осуществлялось без добавления в среду HLDF, имели типичное для инвазивной карциномы неспецифического типа строение с формированием гнезд, кластеров и трабекул, клетки опухоли были вариабельны по своему строению (рис. 1а). Сравнительные данные морфометрического анализа образцов опухолей обработанных и необработанных HLDF представлены в табл. 1.

Рис 1.

Инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа (а) культивирование которой осуществлялось без добавления в среду HLDF: типичное строение с формированием гнезд, кластеров и трабекул, выраженный клеточный и ядерный полиморфизм, среди опухолевых клеток большое количество НДК (стрелками показаны крупные клетки с полиморфными, вариабельными по размеру и форме ядрами с заметными ядрышками); (б) культивирование которой осуществлялось с добавлением в среду HLDF: типичное строение с формированием гнезд, кластеров и трабекул, менее выраженный клеточный и ядерный полиморфизм, среди опухолевых клеток значительно меньшее количество НДК (стрелками показаны мелкие клетки с мономорфными мелкими ядрами с четким контуром и равномерным распределением хроматина). Окраска гематоксилином и эозином, ув. ×400.

При изучении образцов опухолей, культивирование которых осуществлялось с добавлением в среду HLDF, обращал на себя внимание меньший клеточный и ядерный полиморфизм клеток опухоли, значительно реже выявлялись клеточные элементы, ядра которых имели укрупненные ядрышки (рис. 1б).

Добавление HLDF в среду влияло только на соотношение клеток с различной степенью дифференцировки, приводя к снижению относительного содержания НДК и увеличению относительного содержания ВДК. Следовательно, потенциально возможно применение HLDF в дифференцировочной терапии рака молочной железы.

Учитывая, что показатель ядерного полиморфизма является одним из критериев, определяющих степень злокачественности карциномы наряду со способностью к структурообразованию и митозами, было решено обратить более пристальное внимание именно на НДК, обладающих более выраженными признаками как ядерного полиморфизма, так и нарушения структурообразования. Был введен индекс влияния – ИВ HLDF НДК, который равен отношению относительного содержания НДК в образцах опухоли культивируемой без HLDF, к относительному содержанию НДК в образцах, культивируемых с HLDF.

Все пациенты были разделены на две группы – с высокой реакцией на HLDF, заключающейся в том, что относительное количество НДК уменьшилось в 1.6 и более раз и – с отсутствием, или низкой реакцией на HLDF ИВ HLDF НДК менее чем в 1.6 раза. В группу пациентов с высокой реакцией вошло 28 больных, ИВ HLDF НДК у них составил 6.06 (3.24; 11.68). В группу пациентов с низкой реакцией вошло 8 больных, ИВ HLDF НДК у них был равен 1.11 (0.88; 1.57). Морфометрическая оценка клеточного состава образцов опухолей, культивированных без добавления HLDF, показала, что относительное содержание НДК и ВДК отличается между группами, которые в дальнейшем характеризовались высокой или низкой реакцией на HLDF. Так, при высокой реакции клеточный состав опухоли был следующим: НДК – 17.36 (7.59; 23.38), ВДК – 10.13 (6.69; 15.72), а при низкой – НДК – 5.14 (2.36; 8.56), ВДК – 24.46 (13.85; 36.39), р_НДК = 0.004, р_ВДК = = 0.015. Следовательно, высокая реакция клеток опухоли на HLDF связана с более высоким количеством НДК и с более низким количеством ВДК.

Анализ данных клинического обследования пациентов этих групп показал, что все 14 пациентов, имеющих метастазы в регионарные лимфатические узлы, относились к группе с высокой реакцией на HLDF, т.е. образцы наиболее агрессивных опухолей показали более сильную ответную реакцию на воздействие изучаемого фактора дифференцировки.

Таким образом, HLDF способствует приобретению НДК более высокой степени дифференцировки. Более выраженный эффект влияния HLDF наблюдается в более агрессивных формах неоплазий, дающих метастазы, что позволяет рассматривать фактор дифференцировки HLDF как кандидата для применения в дифференцировочной терапии злокачественных новообразований.