Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 495, № 1, стр. 602-606
НОВЫЙ АНЕМОНОТОКСИН RTX-VI ИЗБИРАТЕЛЬНО МОДУЛИРУЕТ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ НАТРИЕВЫЕ КАНАЛЫ
Р. С. Калина 1, *, С. Пеньёр 2, И. Н. Гладких 1, П. С. Дмитренок 1, Н. Ю. Ким 1, Е. В. Лейченко 1, М. М. Монастырная 1, Я. Титгат 2, Э. П. Козловская 1
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии
им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук
Владивосток, Россия
2 Католический университет Левена
Левен, Бельгия
* E-mail: kalinarimma@gmail.com
Поступила в редакцию 03.12.2019
После доработки 02.08.2020
Принята к публикации 03.08.2020
Аннотация
Из этанольного экстракта морской анемоны Heteractis crispa выделен новый нейротоксин RTX-VI, модулирующий потенциал-зависимые натриевые каналы (NaV). Его аминокислотная последовательность была установлена комбинацией методов секвенирования по Эдману и тандемной масс-спектрометрии. RTX-VI является необычным природным аналогом описанного ранее анемонотоксина RTX-III. Молекула RTX-VI состоит из двух дисульфидсвязанных пептидных цепей и лишена аминокислотного остатка Arg13, важного для селективности и сродства нейротоксинов к NaV каналам. Электрофизиологический скрининг на подтипах NaV показал избирательное взаимодействие RTX-VI с натриевыми каналами центральной нервной системы (NaV1.2, NaV1.6) и каналами насекомых (BgNaV1, VdNaV1).
Поиск соединений, способных высокоспецифично взаимодействовать с ионными каналами и/или ионотропными рецепторами, является актуальной задачей современной биоорганической химии, нейрофизиологии, токсинологии и биомедицины. В силу огромного структурного разнообразия и уникальных свойств, нейротоксины природных ядов играют центральную роль в изучении функций различных рецепторных систем сигнальных и проводящих путей организма и представляют интерес в качестве основы для дизайна новых лекарственных препаратов [1].
Морские анемоны (тип кишечнополостные) продуцируют широкий спектр нейротоксинов, модулирующих потенциал-зависимые калиевые и натриевые каналы (КV и NaV) [2, 3], протон-активируемые каналы (ASICs) [4], Са2+-зависимые калиевые каналы (BK и SK) [5], катион неселективные каналы TRPV1 [6] и TRPA1 [7].
Модуляторы NaV каналов – это наиболее изученная на сегодняшний день группа анемонотоксинов отчасти потому, что они являются основными компонентами яда этих животных [3]. Токсины данной группы, связываясь с сайтом 3 (потенциал-чувствительный домен IV) NaV каналов, способны замедлять их быструю инактивацию [1]. Эти пептиды, имеющие молекулярную массу около 5 кДа, классифицируются на основе гомологии их аминокислотных последовательностей и объединяются в четыре структурных типа [3]. Электрофизиологические исследования токсинов ShI и Rp-I – Rp-IV [8, 9] позволили установить общий механизм действия этих пептидов на каналы NaV, но не их фармакологический профиль. При этом детальной электрофизиологической характеристики ни для одного из изученных токсинов не приводилось до настоящего момента.
В данной работе мы сообщаем об изучении нового нейротоксина RTX-VI из тропической морской анемоны Heteractis crispa, описываем его структурные особенности и функциональные свойства.
Недавно нами было показано, что после разделения 70% этанольного экстракта морской анемоны H. crispa на полихроме-1, в 20% этанольной фракции, наряду с модуляторами ASIC каналов, ингибиторами сериновых протеиназ Кунитц-типа и α-амилаз, в значительном количестве присутствовали нейротоксины [4]. В результате последующего разделения фракции с помощью ионообменной хроматографии (Bio-Rex70, SP-Sephadex C-25) и ОФ ВЭЖХ (Luna C18) (рис. 1а) был выделен новый токсин второго структурного типа – RTX-VI (5240.21 Да). Для определения его аминокислотной последовательности дисульфидные связи RTX-VI были восстановлены дитиотреитолом, а остатки Cys алкилированы 4-винилпиридином. После разделения ОФ ВЭЖХ продуктов алкилирования мы получили два пика с молекулярными массами 1509.61 и 4368.05 Да (рис. 1б) вместо одного пика алкилированного пептида с расчетной молекулярной массой 5877.05 Да, соответствующей модификации шести остатков цистеина. Последовательность пептида 1 была определена на основе совокупности данных тандемного масс‑спектра (MC/MC) однозарядного молекулярного иона пептида 1 (1509.61 Да), содержащего пики ионов серий b и y (рис. 1в). МС/МС спектр молекулярного иона полипротонированного пептида 2 (4368.05 Да) не содержал достаточного объема структурной информации. Его аминокислотная последовательность (35 а.о.) была определена деградацией по Эдману. Согласно данным масс-спектрометрии, С-концевой аминокислотный остаток RTX-VI был амидирован. Это согласуется с наличием пострансляционной модификации (отщепление С-концевого остатка глицина), обычно протекающей при созревании данных токсинов [10].
Токсин RTX-VI оказался необычным природным аналогом ранее выделенного из H. crispa пептида RTX-III (δ-SHTX-Hcr1a, UniProt ID: P30832) [11]. Молекула RTX-VI состоит из двух пептидных цепей (12 и 35 а.о.), соединенных двумя дисульфидными связями (С3-С43 и С5-С33, согласно RTX-III); третья дисульфидная связь локализована внутри аминокислотной цепи 2 (C26-C44). Аминокислотная последовательность пептида RTX-VI идентична последовательности RTX-III, за исключением отсутствия остатка Arg13 (рис. 2).
КД спектры пептидов RTX-III и RTX-VI практически идентичны. Около 40% пептидных цепей токсинов находится в конформации β-складка и примерно 20% представляет собой β-изгибы, оставшаяся часть (~40%) – это неупорядоченная структура. Полученные данные КД спектроскопии согласуются с описанием пространственных структур гомологичных нейротоксинов (ApA, ShI) – скрученный антипараллельный β-лист, соединенный тремя петлями, на вершине одной из которых локализован Arg13 [12, 13].
По-видимому, новый токсин RTX-VI является результатом посттрансляционной модификации пептида RTX-III. Ранее сообщалось, что в яде паука Cupiennius salei обнаружен двухцепочечный пептид CSTX-13 со слабой нейротоксической активностью, увеличивающий паралитическую активность токсина CSTX-1 [14].
Электрофизиологический скрининг токсинов RTX-III и RTX-VI на девяти подтипах NaV каналов, экспрессированных в ооцитах лягушки Xenopus laevis, показал, что отсутствие Arg13 в структуре RTX-VI меняет его фармакологический профиль в отношении двух подтипов каналов центральной нервной системы. В отличие от RTX-III, модулирующего NaV1.3 канал, токсин RTX-VI влияет на токи NaV1.2. В то же время активность обоих пептидов в отношении семи других подтипов NaV: каналов насекомых (BgNaV1, VdNaV1), скелетной мускулатуры (NaV1.4), сердечной мышцы (NaV1.5), центральной (NaV1.1, NaV1.6) и периферической (NaV1.8) нервной системы млекопитающих, остается идентичной. Мы полагаем, что Arg13 скорее вносит вклад в селективность токсина по отношению к различным подтипам NaV каналов, нежели играет решающую роль во взаимодействии токсина с каналом [1].
Таким образом, впервые из морской анемоны H. crispa выделен двухцепочечный нейротоксин, RTX-VI. Проведено сравнительное исследование действия RTX-VI и его ближайшего гомолога RTX-III на токи семи подтипов NaV млекопитающих и два подтипа каналов насекомых. Благодаря широкой специфичности анемонотоксинов RTX-III и RTX-VI, они могут быть использованы в качестве инсектицидов и молекулярных инструментов исследования NaV каналов.
Список литературы
Deuis J., Mueller A., Israel M., et al. The pharmacology of voltage-gated sodium channel activators // Neuropharmacology. 2017. V. 127. P. 87–108. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2017.04.0
Sintsova O., Gladkikh I., Chausova V., et al. Peptide fingerprinting of the sea anemone Heteractis magnifica mucus revealed neurotoxins, Kunitz-type proteinase inhibitors and a new β-defensin α-amylase inhibitor // J. Proteomics. 2017. V. 173. P. 12–21. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2017.11.019
Frazão B., Vasconcelos V., Antunes A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview // Mar. Drugs. 2012. V. 10. № 12. P. 1812–1851. https://doi.org/10.3390/md10081812
Kalina R., Gladkikh I., Dmitrenok P., et al. New APETx-like peptides from sea anemone Heteractis crispa modulate ASIC1a channels // Peptides. 2018. V. 104. P. 41–49. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2018.04.013
Rauer H., Pennington M., Cahalan M., et al. Structural conservation of the pores of calcium-activated and voltage-gated potassium channels determined by a sea anemone toxin // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 31. P. 21885–21892. https://doi.org/10.1074/jbc.274.31.21885
Monastyrnaya M., Peigneur S., Zelepuga E., et al. Kunitz-type peptide HCRG21 from the sea anemone Heteractis crispa is a full antagonist of the TRPV1 receptor // Mar. Drugs. 2016. V. 14. № 12. P. 229. https://doi.org/10.3390/md14120229
Logashina Y.A., Mosharova I.V., Korolkova Y.V., et al. Peptide from sea anemone Metridium senile affects transient receptor potential ankyrin-repeat 1 (TRPA1) function and produces analgesic effect // J. Biol. Chem. 2017. V. 292. № 7. P. 2992–3004. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.757369
Schweitz H., Bidard J., Frelin C., et al. Purification, sequence, and pharmacological properties of sea anemone toxins from Radianthus paumotensis. A new class of sea anemone toxins acting on the sodium channel // Biochemistry. 1985. V. 24. № 14. P. 3554–3561. https://doi.org/10.1021/bi00335a025
Salgado V.L., Kem W.R. Actions of three structurally distinct sea anemone toxins on crustacean and insect sodium channels // Toxicon. 1992. V. 30. № 11. P. 1365–1381. https://doi.org/10.1016/0041-0101(92)90512-4
Honma T., Kawahata S., Ishida M., et al. Novel peptide toxins from the sea anemone Stichodactyla haddoni // Peptides. 2008. V. 29. № 4. P. 536–544. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2007.12.010
Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Козловская Э.П., и др. Аминокислотная последовательность нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорг. химия. 1985. Т. 11. № 3. С. 302–310.
Wilcox G.R., Fogh R.H., Norton R.S. Refined structure in solution of the sea anemone neurotoxin ShI // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 33. P. 24707–24719.
Pallaghy P.K., Scanlon M., Monks S., et al. Three-dimensional structure in solution of the polypeptide cardiac stimulant anthopleurin-A // Biochemistry. 1995. V. 34. № 11. P. 3782–3794. https://doi.org/10.1021/bi00011a036
Wullschleger B., Kuhn-Nentwig L., Tromp J., et al. CSTX-13, a highly synergistically acting two-chain neurotoxic enhancer in the venom of the spider Cupiennius salei (Ctenidae) // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. V. 101. № 31. P. 11251–11256. https://doi.org/10.1073/pnas.0402226101
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Доклады Российской академии наук. Науки о жизни