Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 495, № 1, стр. 653-657

Известно, что пребывание в условиях гравитационной разгрузки приводит к атрофическим изменениям в антигравитационных мышцах, в частности, в m. soleus [1]. Развитие мышечной атрофии в этих условиях является следствием ингибирования белкового синтеза и повышения протеолиза [2, 3], в частности, гигантского белка титина (коннектина) [4]. Этот эластичный белок, образуя своеобразную молекулярную пружину, соединяющую концы миозиновых нитей с Z-диском саркомера, регулирует актин-миозиновое взаимодействие, участвует в поддержании высокоупорядоченной саркомерной структуры и мышечной жесткости [5]. Повышенный протеолиз титина, сопровождающийся снижением его содержания, является следствием гиперактивации кальций-зависимых протеаз кальпаинов в условиях гравитационной разгрузки [3, 6]. Показано, что значительное снижение содержания титина происходит только на седьмые сутки гравитационной разгрузки [4].

В последние годы обсуждается участие гистондеацетилаз (HDACs), в том числе HDAC 4 и HDAC 5, в развитии мышечной атрофии. У мышей с двойным нокаутом по HDAC4 и HDAC5 14-суточная денервация сопровождалась значительно меньшим снижением массы скелетных мышц голени, чем у контрольных мышей [7]. Применение ингибитора HDAC4 и HDAC5 трихостатина A снижало степень развития атрофических изменений в m. soleus крысы после 14-суточной гравитационной разгрузки [8]. Однако использование этого ингибитора на фоне 3-суточной гравитационной разгрузки не предотвращало развития атрофии m. soleus у крыс [9]. Таким образом, динамика воздействия HDACs 4/5 на мышечную атрофию при разгрузке остается непонятной.

В данной работе мы исследовали, как ингибирование HDAC4 и HDAC5 влияет на степень развития атрофии m. soleus и содержание титина после 7-суточной гравитационной разгрузки, когда протеолитические изменения в титине наиболее выражены.

Использовали самцов крыс Вистар (210 ± 10 г, виварий ИТЭБ РАН, Пущино). Протокол № 24/2019 от 05 апреля 2019 г. комиссии по биологической безопасности и биоэтике ИТЭБ РАН. Животные были распределены на три группы (по 7 крыс в каждой): 1-я – контрольная, 2-я – вывешивание в течение 7 суток; 3-я – вывешивание в течение 7 суток и внутрибрюшинное введение специфического ингибитора гистондеацетилаз 4 и 5 LMK235 (Sigma–Aldrich) [10] в концентрации 1 мг/кг в сутки. Ингибитор LMK235 растворяли в 2.5% ДМСО (Sigma–Aldrich) в физиологическом растворе и вводили в объеме 200 мкл. Животным 1-й и 2-й групп вводили идентичные объемы 2.5% ДМСО в физиологическом растворе. После эвтаназии крыс трибромэтанолом (240 мг/кг^–1 интраперитонеально, Sigma–Aldrich) камбаловидную мышцу (m. soleus) взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при –75°С.

Обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени проводили по методу [11]. Использовали праймеры, специфичные к генам исследуемых белков (титину (TTN) и референсному гену GAPDH) [11], а также праймеры к гену кальпаина-1 (For: TGAGTGCTTATGAGATGAGG; Rev: GAGTAGCGGGTGATGATGAG). Экстракцию и ДСН-гель-электрофорез гигантского белка титина проводили по методу [4]. Экстракцию кальпаина-1 (основного фермента, протеолизирующего титин) проводили по методу [12]. ДСН-гель-электрофорез кальпаина-1 и GAPDH (референсного белка) проводили в 10% разделяющем ПААГ, используя минисистему Bio-Rad Laboratories. Для проведения вестерн-блоттинга использовали следующие первичные антитела: к кальпаину-1 (1:1000, ab28258, Abcam) и GAPDH (1:1000, ab37168, Abcam). В качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (1:3000, ab6722, Abcam). Для визуализации белковых полос использовали раствор NBT/BCIP (Roche). Денситометрию проводили с помощью компьютерной программы Total Lab v1.11 (Newcastle Upon Tyne). Статистический анализ проводили с помощью пакета SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc.). Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Данные представлены в виде среднего значения (М) ± стандартное отклонение (SD).

Проведенные ранее исследования показали, что гистондеацетилазы класса II (HDAC4 и HDAC5), активируясь в скелетных мышцах в ответ на денервацию, подавляют активность Dach2, который является негативным регулятором миогенина [7]. Миогенин, в свою очередь, активирует атрогин-1- и MuRF1 – Е3 убиквитинлигазы, которые являются частью системы убиквитинопосредованного распада белка в протеасомах. Активация этих ферментов наблюдается в скелетных мышцах при развитии атрофии не только в ответ на денервацию [7], но и в условиях гравитационной разгрузки [13]. При этом увеличивается содержание кальпаина-1 и наблюдается его гиперактивация [3, 6], что вносит существенный вклад в развитие мышечной атрофии за счет повышенного протеолиза белков саркомерного цитоскелета, в частности, титина.

Мы предположили, что ингибирование HDACs 4 и 5 в m. soleus крысы на фоне 7-суточной гравитационной разгрузки должно предотвратить увеличение содержания кальпаина-1, повышенный протеолиз титина и привести к уменьшению уровня развития атрофии. Поскольку HDACs рассматриваются как основные транскрипционные репрессоры, мы предположили, что их ингибирование должно привести к увеличению экспрессии гена TTN.

Различий в массе тела крыс трех групп мы не выявили (табл. 1). Снижение массы m. soleus (на 26.8% и 30.5%, p < 0.01) и индекса “масса m.  soleus/масса тела животного” (на 24.7% и 27.8%, p  < 0.01) мы обнаружили во второй и третьей группах, соответственно, относительно контроля (табл. 1).

Эти данные свидетельствуют об одинаковом уровне развития атрофических изменений в m. soleus крыс второй и третьей групп. Таким образом, наше предположение, что ингибирование HDACs 4 и 5 должно привести к уменьшению уровня развития атрофии m. soleus на 7 сутки разгрузки, не подтвердилось. Однако нашли подтверждение другие наши предположения. В группе с ингибированием HDACs 4/5 содержание кальпаина-1 не отличалось от такового в контрольной группе, в то время как в m. soleus крыс, вывешенных без ингибитора, содержание этого фермента было существенно выше (p < 0.05, рис. 1). Кальций-активируемая протеаза кальпаин-1 является основным ферментом протеолизирующим титин [12]. Показано, что развитие мышечной атрофии в условиях гравитационной разгрузки сопровождается увеличением содержания кальпаина-1 [3], а также повышением активности этой протеазы уже в первые сутки разгрузки [6]. Таким образом, повышенный протеолиз титина кальпаином-1 можно назвать одним из молекулярных триггеров мышечной атрофии, индуцируемой гравитационной разгрузкой. Несомненно, что уменьшение содержания или активности этой протеазы будет способствовать снижению протеолиза титина и других саркомерных белков. Наши результаты согласуются с этим утверждением.

Рис. 1.

Содержание кальпаина-1 в m. soleus. 1 – контроль, 2 – вывешивание 7 суток, 3 – вывешивание 7 суток+ингибитор LMK235 (1 мг/кг). *p < 0.05 по сравнению с группой 1. Статистически значимых различий в содержании мРНК кальпаина-1 в m. soleus трех исследуемых групп крыс не выявлено (данные не показаны).

На рис. 2а,б представлены данные об изменении содержания титина в m. soleus вывешенных крыс. Снижение в 1.62 раза (р < 0.01) содержания интактных молекул титина (Т1) и увеличение в 2.1 раза (р < 0.01) содержания протеолитических Т2-фрагментов наблюдалось в атрофированной камбаловидной мышце крыс второй группы (рис. 2а, 2б, в сравнении с контролем). В третьей группе животных мы обнаружили существенное снижение протеолиза Т1. В частности, содержание интактного T1 было выше (в 1.29 раза, р < 0.01), а содержание Т2-фрагментов было ниже (в 1.26 раза, р < 0.01) в m. soleus крыс третьей группы в сравнении с группой 2 (рис. 2а, 2б). Снижение протеолиза титина в третьей группе может быть связано с отсутствием статистически значимого увеличения содержания кальпаина-1 (рис. 1).

Рис. 2.

Содержание титина (а,б) и экспрессия гена титина (в) в m. soleus. На электрофореграмме титина (а) указаны полосы тяжелых цепей миозина (ТЦМ), небулина, протеолитических Т2-фрагментов титина и изоформ Т1. Молекулярные массы мышечных белков указаны в соответствии с данными, полученными в работе [4]. 1 – контроль, 2 – вывешивание 7 суток, 3 – вывешивание 7 суток + ингибитор LMK235 (1 мг/кг). ** p < 0.01 по сравнению с группой 1; ##p < 0.01 по сравнению с группой 2.

Свой вклад в снижение содержания Т1 в m. soleus крыс второй группы могло внести и значительное уменьшение (в 4.0 раза, р < 0.01) экспрессии гена титина (рис. 2в). В то же время в группе 3 (с ингибированием HDACs4/5) такого снижения не было (рис. 2в).

ВЫВОД

Развитие атрофических изменений в m. soleus крысы после семисуточной гравитационной разгрузки сопровождалось увеличением содержания кальпаина-1, повышением протеолиза титина и снижением экспрессия гена TTN. Ингибирование гистондеацетилаз 4 и 5 на фоне разгрузки не устраняло развитие атрофии, но предотвращало увеличение содержания кальпаина-1, повышенный протеолиз титина и снижение содержания мРНК этого белка.

Учитывая данные о том, что ингибирование HDACs 4/5 предотвращало мышечную атрофию, вызванную 14-суточной гравитационной разгрузкой [8], но не предотвращало атрофию, вызванную 3-суточной [9] и 7-суточной (табл. 1) гравитационной разгрузкой, можно предположить, что эти ферменты вносят меньший вклад в развитие атрофии по сравнению с другими гистондеацетилазами, например, HDAC 1 [11].