Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 496, № 1, стр. 48-51

Хеликаза MLE (Maleless) D. melanogaster и ее ортологи у других организмов, объединяемые под общим названием DHX9, относятся к семейству хеликаз, содержащих консервативный мотив DExH-бокс. Как было показано in vitro, DHX9 способна связывать и расплетать двуцепочечные ДНК, РНК, а также РНК-ДНК-гибриды и другие сложные структуры, образующиеся в ядре эукариотической клетки в процессах репликации, рекомбинации и транскрипции [1].

Для DHX9 человека показано участие в широком спектре процессов регуляции экспрессии генов. У D. melanogaster подробно изучена роль MLE как компонента комплекса дозовой компенсации у самцов [2], однако у других организмов, в частности нематоды и человека, дозовая компенсация достигается по совершенно другим механизмам, в которых DHX9 не участвует.

Хотя у D. melanogaster на протяжении длительного времени MLE изучалась почти исключительно как компонент комплекса дозовой компенсации, в ряде исследований были описаны и дополнительные функции MLE, схожие с функциями DHX9 у других организмов. Было показано, что MLE участвует в сплайсинге, в процессинге мРНК, в РНК-интерференции, взаимодействует с комплексом ремоделирования хроматина NURD и регулирует транскрипцию генов гетерохроматина [3–5]. В нашей предыдущей работе было обнаружено взаимодействие MLE с белком ENY2, консервативное у D. melanogaster и человека [6, 7]. ENY2 – консервативный ядерный белок, который физически взаимодействует с рядом мультибелковых комплексов, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов, в том числе, с ремоделирующим хроматин комплексом SWI/SNF [8].

В настоящей работе было продолжено изучение функций MLE. Были исследованы взаимодействие MLE с комплексом SWI/SNF и участие MLE в SWI/SNF-зависимой транскрипции. Мы провели реакцию иммунопреципитации белков из ядерного эмбрионального экстракта и ядерного экстракта из клеток линии Schneider2 (S2) и обнаружили, что антитела к MLE эффективно копреципитируют субъединицы комплекса SWI/SNF, включая каталитическую субъединицу Brahma (рис. 1а). Таким образом, было показано, что MLE физически взаимодействует с компонентами комплекса ремоделирования хроматина SWI/SNF.

Рис. 1.

Коиммунопреципитация MLE и компонентов комплекса SWI/SNF (a) и профили связывания SWI/SNF и MLE с промотор-проксимальной областью гена ftz-f1 (б и в соответственно). IP – иммунопреципитация, In – исходная фракция эмбрионального ядерного экстракта, Out – фракция эмбрионального ядерного экстракта после инкубации с антителами, IgG – преиммунная сыворотка, которая служит контролем иммунопреципитации. PB (Polybromo), Brm (Brahma), BAP170, Moira – субъединицы комплекса SWI/SNF. По горизонтальной оси отмечено расстояние относительно старта транскрипции гена ftz-f1, п.н. Cтрелкой обозначен старт транскрипции гена, вертикальным прямоугольником – район “задержки” РНК-полимеразы II, горизонтальным прямоугольником – энхансер.

Затем был исследован вопрос об участии MLE в SWI/SNF-зависимой регуляции экспрессии генов. Ранее были подробно исследованы регуляция транскрипции гена экдизонового каскада ftz-f1 и регуляторные области в промотор-проксимальной части этого гена. Ген ftz-f1 кодирует ядерный рецептор, консервативный у высших эукариот. Активация транскрипции гена ftz-f1 у D. melanogaster происходит по механизму “задержки” РНК-полимеразы II и включает так называемую “подготовительную” стадию, адекватное протекание которой обеспечивает высокий уровень транскрипции на последующей стадии активной транскрипции [9,10]. Кроме того, на уровень транскрипции гена ftz-f1 оказывает влияние энхансер, расположенный в дистальной части первого интрона [11]. В этих процессах играет важную роль комплекс SWI/SNF, пики связывания которого находятся на ключевых регуляторных сайтах – промоторе, сайте “задержки” РНК-полимеразы II и интронном энхансере [9,12].

В настоящей работе для изучения роли MLE в регуляции экспрессии гена ftz-f1 была использована ранее разработанная модельная система [9], позволяющая активировать экдизоновый каскад в клетках S2 и детально исследовать ген ftz-f1 на разных стадиях его активации. В отсутствие экдизона в культуральной среде ген ftz-f1 был практически не активен (стадия “–”). После добавления экдизона и последующей инкубации в течение ночи ген находился на подготовительной стадии (стадия “+”). На этой стадии РНК-полимераза II начинает осуществлять транскрипцию, но останавливается на расстоянии ~1.5 т.п.н. от промотора. После отмывки клеток и инкубации в течение 3 часов в среде без экдизона ген ftz-f1 вступал в стадию активной транскрипции (стадия “+; –”).

Методом иммунопреципитации хроматина (ChIP) было исследовано связывание MLE с промотор-проксимальной областью гена ftz-f1 на всех стадиях его транскрипции (рис. 1в). Оказалось, что профиль связывания MLE очень похож на профиль связывания комплекса SWI/SNF [9,12]; для наглядности на рис. 1б представлен профиль связывания Moira – одной из коровых субъединиц комплекса SWI/SNF. MLE, также как SWI/SNF, сильнее всего связан с промотором и энхансером гена, и его связывание усиливается в процессе активации транскрипции.

Следующий вопрос, который мы исследовали – оказывает ли MLE влияние на уровень транскрипции гена ftz-f1 в данной модельной системе. Для решения этого вопроса был сделан нокдаун MLE методом РНК-интерференции. Результаты эксперимента представлены на рис. 2а. Для измерения уровня транскрипции мы использовали метод ОТ-ПЦР в реальном времени и праймеры, расположенные на расстоянии 1900 п.н. от промотора, т.е. “ниже” сайта “задержки” РНК-полимеразы II, чтобы детектировать только полноразмерные транскрипты. На первых двух стадиях в модельной системе на фоне снижения содержания MLE уровень транскрипции гена ftz-f1 повышался. Наиболее заметно (в 3 раза) – на подготовительной стадии транскрипции, для которой ранее было показано особо значимое влияние комплекса SWI/SNF [9, 12].

Рис. 2.

Изменение уровня транскрипции гена ftz-f1 на фоне РНК-интерференции MLE в модельной системе в клетках S2 (а) и на фоне мутации mle [9] in vivo в личинках и предкуколках женского пола (б). Все эксперименты были проведены в трех биологических повторностях. Уровень транскрипции гена ftz-f1 был измерен относительно уровня транскрипции контрольного гена ras.

Нарушение связывания комплекса SWI/SNF с регуляторными последовательностями гена ftz-f1 in vivo приводит к тому, что в процессе метаморфоза ftz-f1 начинает экспрессироваться преждевременно, но его транскрипция остается на низком уровне [9]. Мы исследовали влияние мутации в гене mle на транкрипцию гена ftz-f1 в начале метаморфоза. Чтобы исключить влияние комплекса дозовой компенсации, в эксперименте были использованы только личинки и предкуколки женского пола. Были отобраны самки с генотипом mle [9]/mle [9] (мутация, приводящая к потере функции белка) и самки дикого типа трех возрастных категорий в начале метаморфоза. Чтобы точно определить возраст личинок поздней третьей стадии, использовали метод, основанный на том, что перед началом метаморфоза личинки перестают питаться, и их пищеварительная система освобождается от съеденного ранее корма [13]. Личинок культивировали в стандартных условиях при температуре 25°C с добавлением в корм 0.05% бромфенолового синего. На пятый день развития визуально оценивали наличие синего красителя в пищеварительной системе личинок. Питающиеся личинки были отобраны, как имеющие возраст >8 ч до формирования предкуколки (ДФП), возраст личинок без бромфенолового синего в пищеварительной системе был определен как 2–6 ч ДФП. Третья группа особей – белые предкуколки в течение первого часа после формирования – 0 ч. Результаты представлены на рис. 2б. Как и в предыдущем эксперименте, мы детектировали только полноразмерные транскрипты гена ftz-f1. За 8 ч ДФП ген ftz-f1 транскрибируется на одинаково низком уровне как в мутантах mle [9], так и в контрольных личинках. За 6–2 ч ДФП уровень транскрипции возрастает в 3 раза в личинках дикого типа, и в 2 раза в личинках mle [9]. Наконец, сразу после формирования предкуколки уровень транскрипции быстро возрастает в норме и наоборот несколько снижается в мутантах.

Итак, в настоящей работе было показано, что MLE совместно с комплексом SWI/SNF связывается c регуляторными элементами гена ftz-f1 и влияет на его транскрипцию в модельной системе и in vivo. Мы полагаем, что MLE в процессе экспрессии данного гена выполняет функцию расплетания сложных структур, которые образуются в процессе транскрипции по механизму “задержки” РНК-полимеразы II, а также при формировании петли между промотором и энхансером и одновременном прохождении транскрипции.

DHX9 человека является потенциальной мишенью для терапии, поскольку она вовлечена в репликацию и транскрипцию ряда РНК-содержащих вирусов, и в то же время в иммунный ответ организма на вирусную инфекцию и в злокачественную трансформацию [1,14,15]. Конкретная роль и механизмы работы DHX9 в перечисленных процессах требуют дальнейшего изучения. Поэтому мы считаем важным изучение “универсальных”, потенциально консервативных в эволюции функций MLE вне комплекса дозовой компенсации. Данная работа вносит вклад в эту область знаний.