Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 496, № 1, стр. 99-103

Технология геномного редактирования (gene editing, GE) в сочетании с методом клонирования ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) имеет широкие перспективы применения для решения задач, направленных на создание новых генотипов, в том числе с измененными хозяйственно-полезными признаками [1, 2]. В частности, получение клонированных эмбрионов с использованием эмбриональных фибробластов, в геноме которых инактивирован ген β-лактоглобулина (BGL), и их трансплантация животным-реципиентам ожидаемо позволит получить коров, способных производить молоко с пониженными аллергенными свойствами [3]. Использование системы на основе CRISPR/Cas9 в качестве инструмента редактирования генома соматических клеток следует рассматривать как наиболее эффективный и инновационный подход, находящий все большее применение у домашних животных [4, 5]. Метод SCNT позволяет проводить отбор мутантных клеток перед началом дорогостоящих экспериментов на животных и гарантировать получение потомства с запланированными модификациями генов. Привлекательность системы на основе CRISPR/Cas9 определяется ее высокой эффективностью, простотой и малой трудоемкостью [6].

Целью исследований являлось конструирование SCNT-эмбрионов крупного рогатого скота с использованием эмбриональных фибробластов в качестве доноров ядер, оценка их развития до жизнеспособного потомства, а также в получение культуры индивидуальных фибробластов с нокаутом гена β-лактоглобулина.

Для SCNT выделенные post mortem ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК, n = 1332) созревали в среде ТС-199, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг/мл фолликулостимулирующего и 10 мкг/мл лютеинизирующего гормонов. Через 20–24 ч созревания ОКК обрабатывали 0.1% раствором гиалуронидазы, механически удаляли кумулюсные клетки и отбирали ооциты с первым полярным тельцем (ППТ, n = 1088). Эмбриональные фибробласты культивировали до сформированного монослоя, контактно ингибировали в течение 2 сут и к процедуре переноса в энуклеированный ооцит (рис. 1а) готовили в виде суспензии. Для объединения ооцитов и перенесенных в их перивителлиновое пространство клеток применяли два последовательных импульса постоянного тока напряжением 35 В продолжительностью 20 мкс (однократно или в случае отсутствия признаков объединения клеток – двукратно). Полученные цитогибриды (n = 422, 44.5% от числа ооцитов с ППТ) активировали иономицином через 2 ч после слияния и культивировали до стадии бластоцисты (рис. 1б). С целью оценки полноценности и жизнеспособности полученных эмбрионов часть из них (n = 81) была пересажена синхронизированным по циклу реципиентам, оставшиеся бластоцисты были использованы для цитологического анализа состояния ядерного материала (n = 16, среднее число ядер 78.3). В качестве реципиентов использовали телок случного возраста в спонтанном и синхронизированном цикле. Перед трансплантацией проводили сакральную эпидуральную анестезию 2%-м раствором новокаина. Пересадку эмбрионов (1–6 эмбрионов на одно животное) проводили нехирургическим методом глубоко в рог матки.

Рис. 1.

Фотографии (а) процедуры переноса соматической клетки (показано стрелкой) в перивителлиновое пространство энуклеированного ооцита, (б) клонированных эмбрионов крупного рогатого скота, использованных для трансплантации животным-реципиентам, а также (в) клонированного теленка (полученного в России впервые).

Было установлено, что после активации 64.5% (272/422) цитогибридов формируют 2-х клеточные эмбрионы и 23.0% (97/422) развивается до стадии бластоцисты. Доля стельных животных после трансплантации клонированных бластоцист 31 реципиенту составила 43.8% (14/31), доля рожденного живого потомства – 3.3% (1/31) (рис. 1в).

Для оценки происхождения полученного теленка проводили полногеномное SNP-генотипирование потомства и клеточной линии с использованием ДНК-чипа высокой плотности Bovine GGP HD (Neogen/Illumina Inc., США). Для оценки степени сходства проводили расчет значений дистанций IBS (идентичность по состоянию) с использованием программы PLINK 1.9. Значения IBS дистанций для пары теленок – клеточная линия составили 1.000, что подтверждает идентичность генотипа полученного теленка и клеточной линии (для сравнения, IBS-дистанции между не родственными животными симментальской породы варьируют от 0.731–0.763).

Учитывая, что в геноме крупного рогатого скота ген бета-лактоглобулина (BLG) дуплицирован и представлен двумя близкими паралогами, собственно BLG (PAEP) и BLG подобным геном (LOC100848610), нами была выбрана стратегия, предусматривающая инактивацию обоих генов-паралогов (рис. 2).

Рис. 2.

Схема участков генов (а) PAEP (BLG) и (б) LOC100848610 (BLG подобный белок) в геноме Bos taurus, выбранных в качестве мишени для геномного редактирования. Участки гибридизации праймеров для амплификации геномных фрагментов показаны голубой заливкой. Предполагаемые участки разрезания ДНК системой CRISPR/Cas9 показаны фиолетовой заливкой. Участки гибридизации гидовых РНК показаны желтой заливкой.

При создании генной конструкции на основе CRISPR в качестве основы для инактивации генов PAEP и LOC100848610 был выбран вектор pX458 [7], содержащий гибридный ген Cas9 и зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), кодирующие области которых отделены друг от друга последовательностью, кодирующей P2А пептид. Плазмида pX458 была разрезана эндонуклеазой рестрикции BbsI. С остовом плазмиды были лигированы гибридизованные олигонуклеотиды, содержащие последовательности гидовых РНК. После лигирования и трансформации компетентных клеток E. coli JM109 выросшие колонии были использованы для наращивания биомассы и выделения плазмид, которые на основании подтверждения успешного клонирования конструкций секвенированием были использованы для трансфекции фибробластов крупного рогатого скота. Трансфециро-ванные  соматические клетки, содержащие плазмиду, кодирующую компоненты системы CRISPR/Cas9, были отделены от нетрансфецированных клеток при помощи высокопроизводительного клеточного сортера BD FACSAria III.

Высокопроизводительное секвенирование ампликонов целевых участков генов PAEP и LOC100848610 в предварительно отсортированной популяции эмбриональных фибробластов показало наличие, соответственно, 12 и 7.5% мутантных последовательностей, содержащих делеции и вставки нуклеотидов в местах предполагаемых разрывов.

Для получения индивидуальных колоний GE-фибробластов коровы была проведена электропорация фибробластов ранних пассажей смесью плазмид, кодирующих Cas9 и гРНК, направленных на инактивацию генов PAEP и LOC100848610 (рис. 3а).

Рис. 3.

Микрофотографии (а) общего пула трансфецированных фибробластов Bos taurus через 48 ч после электропорации смесью плазмид, кодирующих Cas9 и гРНК, направленных на инактивацию генов PAEP и LOC100848610 и (б) клеток, экспрессирующих гены компонентов системы CRISPR/Cas9 и GFP (зеленое свечение). (в) культура индивидуальной колонии, трансфецированных клеток. (г) результаты секвенирования ампликона участка гена PAEP и гена LOC100848610. Видны микровставки и микроделеции в области разрезания гена системой CRISPR/Cas9. Генотипы подписаны. Места мутаций обозначены стрелками.

После сортировки (как описано выше, рис. 3б) общий пул клеток, экспрессирующих гены компонентов системы CRISPR/Cas9, растили в течение 2–3 сут, после чего клетки высевали индивидуально в 96-ти луночные планшеты и культивировали до получения колоний (рис. 3в) и формирования ими 80–90% монослоя. Доля сформированных колоний составила 21.3% от общего числа клеток (90/389). Одна часть каждой колонии была заморожена для возможного дальнейшего использования, а другую часть использовали для выделения ДНК и анализа на наличие мутаций. С этой целью проводили амплификацию фрагментов генов PAEP и LOC100848610, содержащих целевые области, с последующим секвенированием по Сэнгеру (рис. 3г). В 4 из 90 полученных колоний индивидуальных фибробластов был установлен нокаут генов PAEP и LOC100848610, что соответствует эффективности геномного редактирования 4.4%.

Таким образом, в результате проведенных исследований подтверждена компетентность линии фетальных фибробластов крупного рогатого скота к развитию до жизнеспособного потомства методом SCNT, впервые с использованием системы CRISPR/Cas9 получена линия эмбриональных фибробластов с нокаутом генов PAEP и LOC100848610. Полученная клеточная линия будет использована для получения GE-потомства крупного рогатого скота с отсутствием синтеза бета-лактоглобулина.