Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 135-138

Спонтанно возникающие мутации у мыши служат основой для понимания функции генов на протяжении более 100 лет. Спонтанная мутация waved alopecia (wal) была исследована и описана Сорокиной и Бландовой в 80-х годах XX века. У мутантных мышей wal/wal формируется волнистый шерстный покров, через месяц после рождения количество волосяных фолликулов резко снижается, а оставшиеся фолликулы деформируются и не продуцируют здоровых нормальных волос (Сорокина, Бландова, 1980). В возрасте 2 мес у мышей наблюдается алопеция, которая представляет собой разреженный волосяной покров, образуются дермальные кисты. Облысение не затрагивает область головы и хвоста (Сорокина, Бландова, 1980; Nakamura et al., 2001). Ген wal действует в эктодермальных клетках волосяного фолликула (Малинина и др 1999). По данным Сорокиной и Бландовой ген wal расположен на 14-й хромосоме на расстоянии 47.0 сМ (Sorokina, Blandova, 1985). Ближайшими соседними картированными генами рядом с локусом wal являются гены Pgia29 и Klf12 (Нестерова, 2010).

Первичной задачей нашего исследования было выявление причины мутантного фенотипа мыши wal/wal на молекулярном уровне, а именно поиск мутантного гена и выявление типа мутации. В ходе работы нам не удалось детектировать изменений ДНК в зоне wal, которые приводили бы к изменению структуры белков, закодированных в соответствующем локусе. Однако у мышей wal обнаружена мутация в гене Slc9a9, ассоциированная с расстройствами аутистического спектра.

В работе были исследованы мыши wal, полученные в Институте общей генетики и мыши wal, приобретенные в питомнике “Андреевка” ФГБУН “Научный центр биомедицинский технологий” ФМБА России. Для того чтобы добиться наибольшей генетической идентичности между мутантной линией мышей wal и референсной Balb/c и сузить вариации генома вне локуса wal, мы провели возвратное скрещивание (бэккросс) этих линий. Мутантное потомство бэккросса линии wal/wal на исходную Balb/c отбирали по характерному волнистому фенотипу (рис. 1). В первую очередь мы исследовали гены-кандидаты, ассоциированные с мутацией в локусе wal. В локус wal входит 8 генов: Pcdh9, Klhl1, Dach1, Mzt1, Bora, Dis3, Pibf1 и Klf5. Проанализировав данный локус, мы выбрали потенциального гена-кандидата – протокадгерин Pcdh9, повреждение в котором может приводить к нарушениям в коже и ее придатках. Гены Pcdh20 и Pcdh17 не входят в локус wal, но располагаются вблизи, поэтому также были отобраны нами в качестве кандидатов. Мы провели секвенирование по Сенгеру экзонов указанных генов-кандидатов с целью выявления мутации, которая может привести к изменению структуры белка. Однако генных вариаций, приводящих к изменению структуры белка, обнаружено не было, последовательности генов Pcdh9, Pcdh17 и Pcdh20 полностью соответствовали стандартным референсным последовательностям этих генов у мыши (GRCm38/mm10), указанных в базе UCSC.

Рис. 1.

Фенотип мышей wal. Для сравнения на фото представлены здоровая мышь Balb/c (снизу) и мышь с мутацией wal (сверху).

Поскольку остальные гены локуса wal не представляли интереса (нарушения в некоторых из них не совместимы с жизнью, в остальных – не затрагивают кожу), мы предположили, что мутация может быть ассоциирована с регуляторной областью гена или его интронными участками и провели полногеномное секвенирование мышей wal в сравнении с мышами линии Balb/c.

Было проведено полногеномное секвенирование двух образцов мышей wal и контрольной мыши Balb/c. Биоинформатическую обработку проводили, сравнивая геномы 3 особей, – первичную мышь wal, мышь wal, полученную в результате бэккросса и мышь Balb/c, а также проводили выравнивание на стандартную референсную последовательность генома мыши (GRCm38/mm10).

Координаты локуса wal включают примерно 10 млн п.о. (chr14:91,114,870-100,150,000). Предположив, что координаты могут быть неточными, мы расширили зону поиска на 10 млн п.о. В геномном интервале chr14:85,000,000-105,000,000, где ранее был картирован локус wal, у мутантной мыши мы не обнаружили вариантов, приводящих к изменению последовательностей белковых продуктов генов (миссенс, нонсенс, делеций и инсерций в кодирующих участках генов, мутаций в канонических сайтах сплайсинга, мутаций в старт- и стоп-кодонах), что подтвердило результаты секвенирования по Сенгеру. Не было найдено ни одной мутации структурного гена и на протяжении всей хромосомы 14. При поиске рассматривались только варианты, присутствующие у мутантных образцов в гомозиготном состоянии и отсутствующие у контрольного образца.

Среди остальных вариантов была проведена фильтрация по следующим параметрам: зиготность: гомозиготное состояние; ненахождение в участках однонуклеотидных и прочих повторов (в частности, по данным RepeatMasker); отсутствие варианта в базе dbSNP и у мышей различных линий, в том числе Balb/cJ, согласно базе Sanger Institute Mouse Genome Projects; нуклеотидная консервативность позиции у млекопитающих не менее 90%, по данным множественного выравнивания геномов MultiZ 60-Way. С учетом этих критериев нами не обнаружено генетических изменений в интронных областях и в межгенных участках в интервале chr14:85,000,000–105,000,000, которые могли бы уложиться в простую молекулярную модель, объясняющую природу облысения мышей wal.

Интересно отметить, что у мышей описана мутация гена Scel (белок sciellin), фенотипически схожая с мутацией wal (Baden et al., 2005). Белок sciellin является структурным белком роговой оболочки терминально дифференцированных кератиноцитов (Kvedar et al., 1992), был картирован на 14-й хромосоме рядом с областью wal. Однако у исследованных нами мышей этот белок не затронут. Также в исследованиях с помощью иммуногистохимического анализа было показано, что мыши wal синтезируют полноценный белок sciellin (Baden et al., 2005).

Интересной находкой, хоть вероятно и не имеющей отношения к основному фенотипу, явилась мутация в гене Slc9a9, находящемся вне локуса wal на другой хромосоме. Выявленный в гомозиготном состоянии вариант chr9:95019132G>GA (инсерция одного нуклеотида – аденина) расположен в 10 экзоне гена Slc9a9 и приводит к сдвигу рамки считывания, начиная с 374 кодона (p.Asn374fs, ENSMUST00000033463) (рис. 2).

Рис. 2.

Молекулярная природа мутации в гене Slc9a9. Выявленный в гомозиготном состоянии вариант chr9:95019132G>GA (инсерция одного нуклеотида – аденина) расположен в 10 экзоне гена Slc9a9 и приводит к сдвигу рамки считывания, начиная с 374 кодона. Координаты даны по сборке генома GRCm38/mm10 из браузера UCSC. Экзоны пронумерованы, цифры под экзонами указывают на их длину.

Эта мутация была обнаружена как у исходной мутантной мыши wal, так и у полученной после бэккросса. Из литературы известно, что мыши, нокаутные по гену Slc9a9, демонстрируют, в числе ряда прочих признаков, нарушения поведения, сходные с расстройствами аутистического спектра, и другие нейропсихиатрические нарушения, но признаки алопеции не проявляют (Patak et al., 2016; Yang et al., 2016; Ullman et al., 2018). По совокупности сведений вариант следует расценивать как вероятно патогенный в статусе вторичной (случайной) находки. В мировой литературе еще не описаны мыши со спонтанной мутацией в гене Slc9a9, однако генно-инженерные мутанты созданы (Yang et al., 2016; Ullman et al., 2018).

Таким образом, в геномном интервале chr14:85,000,000-105,000,000, где ранее был картирован локус wal, у мутантной мыши не обнаружено вариантов, приводящих к изменению последовательностей белковых продуктов генов. Вероятно, что у мутации нестандартный тип (например, вставка ретротранспозона в область регуляторного элемента). Можно также предположить, что локус определен неверно. Еще одной возможной причиной можно рассматривать ограничения биоинформатического анализа. Метод не позволяет выявлять вариации длины повторов (в том числе экспансии триплетов), а также мутации в генах, у которых в геноме существует близкий по последовательности паралог (псевдоген). Метод не предназначен для определения фазы пар гетерозиготных мутаций, а также для оценки уровня метилирования, выявления сложных хромосомных перестроек, полиплоидии, выявления мутаций в состоянии мозаицизма.

Мутация wal представляет большой интерес и заслуживает дальнейших исследований.