Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 160-164

Важной особенностью развития злокачественной опухоли считают ее уход от иммунологического надзора, что способствует его прогрессированию заболевания. Опухолевые клетки и инфильтрирующие иммунные клетки продуцируют факторы, которые модифицируют микроокружение, придавая ему иммуносупрессивный фенотип. Одними из основных факторов, опосредующих иммуносупрессию, являются PD-1, PD-L1 и IDO1. PD-1 – мембранный рецептор I типа, принадлежащий к семейству CD28/CTLA-4 регуляторов Т-клеток и экспрессирующийся на их поверхности. PD-L1 (B7-H1, CD274) [1] и PD-L2 (B7-DC, CD273) [2] – основные лиганды рецептора PD-1. Активация ключевой точки PD-1/PD-L1 стимулирует апоптоз антиген-специфичных Т-лимфоцитов и подавляет апоптоз регуляторных супрессорных Т-клеток, что является одним из механизмов иммуносупрессии опухоли [3]. IDO1 (indoleamine-2,3-dioxygenase) – фермент, активация которого приводит к деградации L-триптофана (Trp) с образованием N-формилкинуренина [4], а далее целого ряда продуктов, что способствует гибели эффекторных Т-клеток и привлечению Т-клеток регуляторного фенотипа [5, 6].

Целью данной работы было проведение комплексного исследования содержания растворимых форм PD-1, PD-L1 (sPD-1, sPD-L1) в сыворотке крови и уровня их экспрессии в опухоли, а также экспрессии IDO1 в опухолях больных колоректальным раком (КРР), с последующим анализом их ассоциации с клинико-морфологическими характеристиками заболевания и корреляционных связей между указанными маркерами.

В исследование включили 85 первичных больных КРР и 27 здоровых доноров, составивших группу контроля, проходивших обследование и лечение в ФГБУ “НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло-хина” Минздрава России. Все процедуры, выполненные в исследовании с участием больных и здоровых людей, соответствуют этическим стандартам этического комитета организации и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участника получено информированное добровольное согласие. Клинический диагноз у всех пациентов подтвержден данными морфологического исследования опухоли согласно Международной гистологической классификации опухолей пищеварительной системы (ВОЗ, 2019), у всех пациентов выявлена аденокарцинома толстой кишки. Характеристика исследуемой выборки больных КРР представлена в табл. 1.

Концентрацию sPD-L1 и sPD-1 определяли в сыворотке крови методом прямого иммуноферментного анализа Human PD-L1 Platinum ELISA и Human PD-1 ELISA kit (Affimetrix, eBioscience, США). Разделение на группы с низким и высоким содержанием sPD1 и sPD-L1 в сыворотке крови проводили относительного их средних значений. Оценку уровня экспрессии PD-L1 и IDO1 в опухолях проводили методом иммуногистохимии (ИГХ) по стандартной методике с использованием антител к PD-L1 (клон 4Е12; Р-Фарм, Россия) и IDO1 (клон D5J4E, Cell Signaling Technology, USA). Для IDO1 и PD-L1 оценивали экспрессию в опухолевых клетках и строме. В зависимости от экспрессии IDO1 и PD-L1 в опухолевых клетках образцы разделены на 2 группы: с наличием и отсутствием экспрессии.

При оценке стромы образцы опухолей разделили на 3 группы с учетом количества PD-L1+ клеток: 0 – отсутствие PD-L1+ клеток, 1 – низкое содержание PD-L1+ клеток, 2 – высокое содержание PD-L1+ клеток. По экспрессии IDO1 в строме опухоли образцы разделили на 2 группы: 1 – отсутствие или низкое содержание IDO1+ клеток; 2 – высокое содержание IDO1+ клеток (рис. 2).

Рис. 1.

1) Сравнительный анализ уровня экспрессии sPD-1 и sPD-L1 у больных КРР и здоровых доноров. 2) ROC-анализ для sPD1 и sPD-L1 у больных КРР: площадь под ROC-кривой составляет 0.694 (69%) для sPD-L1 и 0.649 (64%) для sPD1.

Рис. 2.

Экспрессия IDO1 и PD-L1 при КРР. Отсутствие экспрессии IDO1 (1) в опухолевых клетках и PD-L1 (5) в опухолевых и стромальных клетках. Экспрессия IDO1 (2) и PD-L1 (6) в опухолевых и стромальных клетках. Низкое содержание IDO1+ (3) и PD-L1+ (7) клеток в строме опухоли. Высокое содержание IDO1+ (4) и PD-L1+ (8) клеток в строме опухоли.

sPD-1 и sPD-L1 при КРР. Анализ результатов исследования показал, что среднее содержание sPD-1 в сыворотке крови здоровых доноров составило 53.07 ± 24.23 пг/мл (11.37–137.8), в группе пациентов с аденокарциномой толстой кишки 47.99 ± 39.32 пг/мл (9.51–287.0). Среднее содержание sPD-L1 в сыворотке крови здоровых доноров составило 13.25 ± 10.17 пг/мл (5.19–56.6), в группе пациентов с аденокарциномой 8.82 ± 4.52 пг/мл (3.19–32.81). Результаты представлены на рис. 1.

Проведенный анализ показал, что у больных КРР наблюдается статистически значимое снижение содержания sPD-1 и sPD-L1 (p = 0.0021 и p = 0.0197 соответственно) в сыворотке крови по сравнению с контролем. Для оценки диагностической значимости снижения уровня содержания PD-1 и PD-L1 в сыворотке крови в качестве маркера КРР проведен ROC анализ. Площадь под ROC-кривой, равная 0.694 для PD-1 и 0.649 для PD-L1, свидетельствует о среднем качестве модели, что не позволяет использовать полученные данные для диагностических целей.

Уровни sPD-1, sPD-L1 и клинико-морфологические характеристики КРР. Провели анализ уровней sPD-1 и sPD-L1 в сыворотке крови больных КРР в зависимости от основных клинико-морфологических характеристик заболевания, результаты представлены в табл. 2.

Выявили, что содержание в сыворотке крови рецептора sPD-1 связано с возрастом, у пациентов в возрасте ≤60 лет уровень маркера ниже по сравнению со старшей возрастной группой (>60 лет). Необходимо отметить, что концентрация sPD-1 и sPD-L1 ассоциирована с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. В группе пациентов с регионарными метастазами КРР наблюдали более высокое содержание исследуемых маркеров по сравнению с пациентами без распространения опухолевого процесса в лимфоузлах.

Экспрессия PD-L1 и IDO1 при КРР. Методом ИГХ провели анализ экспрессии PD-L1 и IDO1 в опухолях больных КРР. Обнаружено, что в опухолевых клетках PD-L1 экспрессируется в 26% случаев (22 из 85), а IDO1 в 36% (31 из 85). В строме опухолей IDO1 обнаружен в большинстве образцов, однако сильную инфильтрацию IDO1+ клетками стромы наблюдали в 34% случаев (29 из 85). Для PD-L1 результаты отличались. А именно, 35% образцов (30 из 85) не содержали PD-L1+ клеток в опухолевой строме. В остальных исследованных образцах отмечено наличие PD-L1+ клеток в строме: 35% образцов (30 из 85) составили группу с низкой инфильтрацией и 29% образцов (25 из 85) составили группу с высокой инфильтрацией (рис. 2).

Далее провели анализ ассоциации уровней экспрессии PD-L1 и IDO1 в опухолях с клинико-морфологическими характеристиками КРР. Результаты представлены в табл. 3.

Нами выявлено, что только содержание PD-L1+ клеток в строме опухолей ассоциировано со стадией КРР. На начальных I-II стадиях заболевания чаще наблюдали высокую инфильтрацию стромы опухоли PD-L1+ клетками по сравнению с поздними III-IV стадиями.

Корреляционные связи между растворимыми и тканевыми формами PD1, PD-L1 и IDO1. Провели корреляционный анализ экспрессии исследуемых белков с помощью определения коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Результаты представлены на рис. 3.

Рис. 3.

Корреляционный анализ между экспрессией растворимых и тканевых форм PD-1, PD-L1 и IDO1 (коэффициент корреляции Спирмена).

Показано, что растворимые формы исследованных белков (sPD-1 и sPD-L1) статистически значимо коррелировали между собой (r = 0.34; p = 0.001). Также была выявлена корреляционная связь между экспрессией IDO1 в опухолевых клетках и клетках стромы (r = 0.33; p = 0.002) и PD-L1 в опухолевых клетках и строме (0.51; p < 0.001).

Кроме того, обнаружена корреляционная зависимость между количеством PD-L1 и IDO1 в опухолевых клетках (r = 0.56; p < 0.001) и в строме (r = 0.61; p < 0.001). Статистически значимых корреляционных зависимостей между концентрациями sPD-1, sPD-L1 в сыворотке крови больных КРР и уровнями экспрессии этих маркеров в первичной опухоли не было выявлено. Полученные данные указывают на необходимость дополнительных исследований с целью подтверждения возможности использования исследованных маркеров для диагностических целей.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯИсследование выполнено при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований, проект 20-015-00479.