Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 185-189

Нейробластома – один из наиболее распространенных видов раковых опухолей у младенцев, возникающая из нейробластов во время эмбрионального развития. Этот рак трудно поддается лечению, часто обнаруживается устойчивость к химиотерапии и является причиной почти 15% смертей от рака у детей. Одним из способов лечения таких опухолей, кроме химиотерапии, является создание условий для активации дифференцировки клеток нейробластомы.

Наша цель – использовать модель дифференцировки нейробластом человека in vitro для изучения молекулярных событий и изменений активности различных сигнальных путей, сопровождающих этот процесс. Новые знания о молекулярных путях, регулирующие дифференцировку нейробластомы, могут помочь в разработке инновационных терапевтических подходов и улучшить существующие методы лечения.

Нами был проведен полнотранскриптомный анализ экспрессии генов в недифференцированной и дифференцированной in vitro линии клеток нейробластомы IMR-32 человека и определены сигнальные пути и биологические процессы, претерпевающие наибольшие изменения при индуцированной дифференцировке нейробластомы.

В настоящее время используется несколько способов дифференцировки клеток нейробластомы in vitro: стимуляция с помощью BrdU, ретиноевой кислоты, культивирование в бессывороточной среде. В клинике для нейробластом, которые проявляют относительную устойчивость к дифференцировке, индуцированной ретиноидами, ведется поиск дополнительных индукторов [1].

IMR32 относительно устойчива к дифференцировке, индуцированной ретиноевой кислотой, поэтому мы использовали для индукции дифференцировки 5-бром-2'-дезоксиуридин (BrdU). Клеточная линия нейробластомы человека IMR-32 претерпевает заметную дифференцировку в ответ на BrdU [2]. BrdU индуцирует морфологическую дифференцировку, а также увеличение количества потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов [2]. Кроме того, BrdU вызывает повышение содержания нейромедиаторов [3]. Клетки IMR-32 приобретают регулируемые секреторные свойства после дифференцировки, индуцированной in vitro: они собирают секреторные органеллы “de novo” и способны накапливать дофамин и высвобождать нейротрансмиттер в ответ на стимулы. Между дифференцированными клетками формируются специализированные клеточные контакты [4, 3 ]. Дифференцировка нейронов вызывает активацию Са²⁺-каналов [4, 2 ].

При дифференцировке нейробластомы in vitro происходит активации Akt и ERK1/2. Как известно, PI3K-Akt играет важную роль в перестройках цитоскелета, необходимых для дифференцировки [5]. Кроме того, в клетках дифференцированной IMR-32 снижаются уровни экспрессии факторов транскрипции протоонкогена MYCN и c-MYB (c-myb) [6].

Для изучения изменения экспрессии генов при дифференцировке нейробластомы IMR32 (Российская коллекция культур клеток, Институт цитологии, Санкт-Петербург, Россия) было проведено полнотранскриптомное секвенирование (RNA-Seq). Были выполнены три независимых биологических повтора для дифференцированной IMR32 и для недифференцированной IMR32. Клетки IMR32 культивировали в среде MEM, содержащей 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Дифференцировку нейробластомы IMR32 проводили в той же культуральной среде при добавлении 2.5 мкМ BrdU в течение 16 дней, среду для культивирования меняли каждые 3 дня.

мРНК выделяли с использованием модуля магнитной изоляции мРНК NEBNext Poly (A) (NEB#E7490). NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit для Illumina (NEB#E7760) использовали 3 мкг тотальной РНК для создания библиотек для секвенирования. Библиотеки РНК были подготовлены для секвенирования с использованием стандартных протоколов Illumina. Двухцепочечную кДНК, продукты реакции лигирования и продукты реакции ПЦР очищали с использованием гранул AgencourtAMPure XP.

Распределение библиотек кДНК по размеру оценивали после ПЦР (12 циклов) с использованием Agilent BioAnalyzer. Профили мРНК 16-дневной дифференциации клеток нейробластомы IMR32 и недифференцированной нейробластомы IMR32 были получены путем глубокого секвенирования в трех повторах с использованием Illumina NovaSeq. Для каждого образца было получено от 28 до 35 млн прочтений. Картирование полученных последовательностей в геном человека (hg38) выполнялось с использованием программного обеспечения hisat. Полученные данные были использованы для функционального анализа дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ), который был проведен с использованием следующих интернет-ресурсов: (GO; DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp): GOTERM BP FAT (биологический процесс) и KEGG Pathway (www.genome.jp/kegg/pathway.html)). Программа DAVID рассчитывает модифицированное точное P-значение Фишера, чтобы выявить обогащение GO или молекулярного пути. В качестве критерия отсечения было выбрано значение р < 0.01.

Данные RNA-Seq (доступны в GEO, номер GSE161759) показали, что при дифференцировке нейробластомы IMR32 в течение 16 дней in vitro изменяется транскрипция 3748 генов с FDR <0.01 (значение p, скорректированное для множественного тестирования). Уровни транскрипции 2482 генов увеличились, тогда как уровни транскрипции 1266 генов снизились.

Анализ ДЭГ (Functional Annotation DAVID Bioinformatic Resourses 6.8) показал, что дифференцировка IMR32 приводит к массированной активации генов, вовлеченных в процессы нейрональной дифференцировки и всех сопровождающих ее событий: генерация нейронов, организацию и формирование синапсов, синаптическую передачу, регуляцию транс-синаптической передачи, клеточную адгезию, регуляцию межклеточной коммуникации. Активация генов при дифференцировке IMR32 не ограничивается исключительно нейроспецифическими процессами, но также затрагивает гены, которые участвуют в органогенезе у приматов (рис. 1).

Рис. 1.

GO_terms_Tree – 30 наиболее значимых кластеров обогащения дифференциально экспрессирующихся генов. Цифры означают – Log2 p-Value для каждого кластера (биологического процесса).

Анализ полнотранскриптомных изменений при дифференцировке нейробластомы показывает, что в результате формируется сложная гетерогенная популяция нервных клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки. В популяции клеток дифференцирующейся нейробластомы экспрессируются гены, которыми обогащены кортикальные нейрональные прогениторные клетки: радиальные глиальные клетки и промежуточные клетки-предшественники нейронов коры больших полушарий головного мозга: FDZ8, HES1, HOPX, PDGFD, PROM1, Sox2, TNC, VIM, ALDOC, BTG2, FABP7, EGR1, FOS, POU3F2, RND [7]. Например, FABP7 необходим для создания системы радиальных глиальных волокон в развивающемся мозге для миграции незрелых нейронов с целью образования корковых слоев. Понижается экспрессия гена Pax6, экспрессия которого in vivo подавляется при дифференцировке в промежуточные клетки-предшественники нейронов. Одновременно присутствуют клетки, экспрессирующие маркеры ранних постмитотических нейронов: NeuroD1, nhlh1, lhx9, POU3F1, MYT1L, lno3, lnoD1, lHx8 [8].

Важно отметить, что нейрональные клетки дифференцируются в нескольких разных направлениях по типу медиатора синаптической передачи. Формируются серотонинэргические клетки, дофаминэргические клетки, глютаматэргические клетки, GABA-эргические и холинэргические клетки. Дифференцировка IMR32 приводит к увеличению экспрессии генов, которые участвуют в химической синаптической передаче и взаимодействиях нейроактивный лиганд-рецептор.

Дифференцировка IMR32 активирует гены, которые отвечают за взаимодействие нервных клеток друг с другом, с внеклеточным матриксом, а также гены, участвующие в перестройке внеклеточного матрикса. Функциональный анализ генов показал, что согласно DAVID Bioinformatic Resourse 6.8 для активированных генов, изменения происходят в следующих клеточных процессах (GOTEM_BP_DIRECT): организация и разборка внеклеточного матрикса (HTRA1, TIMP2, TIMP3, BCAN, DCN, ENG, FN1, GSN, KLK4, MMP15, MMP2, MMP10), адгезия к клеточному матриксу (COL3A1, COL5A1, COL5A3, COL6A5, COL6A3, COL9A1, COL6A6, ECM2, FBLN5), интегрины (ITGA2, ITGA3, ITGA6, ITGA8, ITGА5, ITGB5, ITGA11 и NPNT), гены, участвующие в катаболических процессах коллагена, в регуляции миграции клеток (KEGG_PATHWAY). Следовательно, дифференцировка IMR32 регулирует динамику фокальной адгезии и миграцию дифференцирующихся нервных клеток.

Дифференцировка нейробластомы IMR32 сопровождается активацией сигнальных путей, которые вовлечены в нейрогенез и регулируют пролиферацию, дифференцировку и выживание нервных клеток (рис. 2а, 2б).

Рис. 2.

Функциональный анализ обогащения дифференциально экспрессируемых генов для дифференцированной нейробластомы IMR32. Генная онтология (GO) KEGG Pathway (сигнальные пути) (а) и GOTERM BP FAT (биологический процесс) (б) для активированных дифференциально экспрессирующихся генов.

Дифференцировка клеток IMR32 приводит к замедлению клеточных делений и к подавлению экспрессии 1266 генов, большая часть которых связана с клеточным циклом. Значительно подавляется экспрессия генов E2F1, E2F2, E2F7, c-Myb. Гены с пониженной регуляцией связаны с такими процессами, как деление клетки, переход G1/S, переход G2/M (GOTEM_BP_DIRECT); клеточный цикл (1.2Е-18) и репликация ДНК (6.6Е-20) (KEGG_PATHWAY).

Из полученных результатов следует, что нейробластные клетки IMR-32 в процессе дифференцировки in vitro приобретают характеристики гетерогенной популяции дифференцирующихся нейронов человека и могут использоваться для изучения экспрессии генов и активации сигнальных внутриклеточных систем в процессе развития.

Однако следует отметить, что при дифференцировке клеток IMR-32 наблюдается усиление транскрипции некоторых генов, экспрессия которых в норме при дифференцировке нейрональных клеток in vivo подавляется. Например, увеличивается экспрессия Sox2, который сохраняет нервные клетки недифференцированными и подавляет дифференцировку нейронов. Увеличивается экспрессия PROM1, который выполняет функцию поддержания свойств стволовых клеток. В клетках нейробластомы PROM1 подавляет клеточную дифференцировку зависимым от RET образом [9].

Таким образом, в гетерогенной популяции дифференцирующихся клеток нейробластомы присутствуют клетки, дифференцировка которых подавляется. Учитывать существование таких клеток в популяции дифференцирующейся нейробластомы важно при разработке тактики лечения и подборе альтернативного комбинированного подхода для пациентов с нейробластомой. Устойчивость таких опухолей к комбинированной терапии может возникать в результате присутствия в популяции низкодифференцированных клеток, которые плохо поддаются дифференцировке и устойчивы к химиотерапии. Важно определить факторы, максимально снижающие в популяции клеток дифференцирующейся нейробластомы экспрессию генов, характерных для кортикальных нейрональных прогениторных клеток.

Также важно отметить, что нейробластомы обычно лечат путем индукции дифференцировки с помощью ретиноевой кислоты (РА), однако, не все нейробластомы хорошо отвечают на индукцию РА. Ретиноевая кислота, также как BrdU, не подавляет экспрессию Sox2 в клетках IMR-32. Однако эффективным для подавления Sox2 является оверэкспрессия PPARβ/δ. Предполагают, что комбинаторная активация как RARα, так и PPARβ/δ может быть подходящей в качестве альтернативного терапевтического подхода для пациентов с резистентной к ретиноидам нейробластомой [10]. Для таких нейробластом необходим поиск дополнительных индукторов. Было предложено использование силденафила [1] и экстракта Tinospora cordifolia [11] для дифференцировки нейробластом, устойчивых к РА. Также использование тидеглусиба для лечения нейробластом [12]

Новые знания о молекулярных путях, регулирующих развитие и прогрессирование нейробластомы, позволят разработать инновационные терапевтические подходы и улучшить существующие методы лечения. Наши результаты могут быть применены для улучшения терапии индукции дифференцировки для пациентов с нейро-бластомами.