Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 499, № 1, стр. 332-337

С каждым годом в мире растет число онкологических заболеваний, и в большинстве случаев лучевая терапия является основным средством лечения. Обычно в качестве лучевой терапии используют фотоны, которые характеризуются экспоненциальным уменьшением дозы, т.е. торможение частиц происходит в основном перед опухолью в здоровых тканях, что способствует появлению острых лучевых поражений после лечения. В настоящее время все активнее для лечения рака применяют протоны, преимущества которых связаны с их дозовым распределением, описываемым кривой Брэгга: относительно низкой дозой на входе и наличием пика Брэгга – максимального энерговыделения в конце пробега частицы на заранее заданной глубине, непосредственно в опухоли, что позволяет не повреждать окружающие здоровые ткани, снижая вероятность побочных лучевых реакций [1]. Протонную терапию (ПТ) рассматривают как альтернативу традиционной лучевой терапии, особенно в педиатрии [2] и для лечения опухолей сложных локализаций, близко расположенных к критически важным органам, например, опухоли глаз [3], легких [4], простаты [5]. Хотя физические свойства протонов хорошо изучены, об особенностях их биологического действия известно гораздо меньше. В клинической практике коэффициент относительной биологической эффективности (ОБЭ) протонного излучения относительно высокоэнергетичных фотонов равен 1.1 [6]. В последние годы фиксированное значение ОБЭ ставится под сомнение с позиции оценки безопасности, так как если доза в опухоли слишком низкая, то риск рецидива увеличивается, а если завышена, то возрастает вероятность возникновения побочных эффектов [7]. В работе, проведенной на фибробластах человека AG01522 и клетках глиомы U87 с использованием моноэнергетических протонов с энергией 62 МэВ, было показано, что ОБЭ изменяется с 1.0 на входе в ткани до 1.3–1.4 в пике Брэгга [8]. Основной проблемой при исследовании действия ускоренных частиц на биологические объекты является то, что величина ОБЭ зависит от многих факторов, как биологического характера: вида, пола, возраста животного; линии культивируемых клеток млекопитающих; метода регистрации повреждений, концентрации кислорода в тканях, стадии клеточного цикла, условий культивирования in vitro и метаболизма in vivo, так и физико-технических характеристик облучения: способа доставки и расчета дозы, дозы за фракцию, величины линейной передачи энергии (ЛПЭ) частиц, состава и однородности пучка ионов и вторичного излучения. В последнее время медицинские центры для ПТ опухолей используют метод тонкого сканирующего пучка протонов (ТСПП), который обеспечивает наиболее эффективное лечение с модулированной интенсивностью, позволяя максимально снизить дозовую нагрузку на здоровые ткани. Дальнейшее улучшение качества ПТ можно достичь корректной оценкой ОБЭ по всему диапазону кривой Брэгга.

Большинство работ по определению величины ОБЭ протонов выполнено при облучении in vitro культур нормальных и опухолевых клеток с использованием низкоэнергетических пучков [9], и полученные результаты трудно экстраполировать для решения практических задач ПТ, при которой в современных центрах используют высокоэнергетические протоны. В данный момент начинают накапливаться экспериментальные данные по действию пучков протонов разных энергий, конфигураций и ЛПЭ на целый организм, которых пока недостаточно, и, как следствие, отсутствуют представления о специфике действия высокоэнергетических частиц на критические структуры и процессы в различных органах и тканях при тотальном или локальном облучении животных в дозах, рассчитанных для межпланетного полета, а также при дозах, которые планируют использовать для гипофракционированного облучения опухолей.

Целью работы являлись изучение радиочувствительности мышей в диапазоне доз 4.5–15 Гр после тотального облучения ТСПП в разных областях кривой Брэгга и определение коэффициента ОБЭ по тесту 30-суточной выживаемости.

Эксперименты проводили на 260 мышах самцах колонии SHK с массой тела 30–35 г, которых содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с требованиями Федерации европейских научных ассоциаций по содержанию и использованию лабораторных животных в научных исследованиях [10], а план экспериментов был одобрен Комиссией ИТЭБ РАН по биологической безопасности и биоэтике (протокол № 8/2020 от 17.02.2020). Мыши были разделены на группы по 10–15 животных, и по отдельным экспериментальным точкам проведено 2–3 независимых эксперимента. Мышей облучали в пике и до пика Брэгга в дозах 4.5–15 Гр. Облучение осуществлялось на протонном синхротроне (Комплекс ПТ “Прометеус”, ФТЦ ФИАН, Протвино) с применением технологии сканирующего пучка с одного направления в импульсном режиме (длительность импульса 200 мс, 1 импульс в 2 с) и сигмой пучка – 2.8–3.6 мм. Облучение животных проводилось путем сканирования пучком протонов всего тела с равномерным распределением дозы по всему объему. Перед облучением мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией ксилазин/золетиловой смеси (0.7/3.4 мг/кг). Животных по одному располагали перпендикулярно правой стороной тела к оси пучка на расстоянии 75 см от выпускного окна ускорителя. При облучении в модифицированном пике Брэгга перед контейнером с животным располагался 60 мм водный фантом, для смещения энергии протонов в диапазон более 70 МэВ, чтобы получить более однородное дозовое распределение в теле животного с хорошим градиентом доз на границах мишени. При облучении в модифицированном пике Брэгга мощность дозы была 0.82 Гр/мин, число частиц 1.51 × 10¹¹–5.05 × 10¹¹ в зависимости от дозы, энергия частиц на выходе из ускорителя составляла 91–123 МэВ. Среднее значение ЛПЭ, рассчитанное по программе планирования, в модифицированном пике было равно 2.5 ± 0.7 кэВ/мкм. При облучении до пика Брэгга энергия частиц составляла 150 МэВ, что соответствует ЛПЭ на плато 0.7 ± 0.04 кэВ/мкм, при мощности дозы 0.47 Гр/мин (число частиц 3.67 × 10¹¹–1.22 × 10¹²). Контролировали дозу клиническим дозиметром на основе алмазного детектора (ИФТП, Россия) и дозиметрической пленкой (EBT2, США), погрешность поглощенной дозы протонов составляла около 5%.

Для определения коэффициента ОБЭ контрольные группы мышей были облучены жестким рентгеновским излучением (РИ) на установке РУТ (200 кВ, 2 кэВ/мкм, 1 Гр/мин; Центр коллективного пользования “Источники излучения” ИБК, Пущино). Облучение мышей РИ, которое является фотонным, происходило равномерно по всему телу. Животные этой группы также служили sham-контролем, так как подвергались анестезии и транспортировке к источникам облучения.

Затем в течение 30 сут после радиационного воздействия ежедневно учитывали число павших животных, а также мышей взвешивали дважды в неделю. По итогам наблюдений получали кривые выживаемости, по которым оценивали динамику гибели и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) погибших от облучения мышей.

Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке с вычислением среднего значения показателя и его ошибки. Достоверность различий между выборками оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Вероятность ошибки p < 0.05 считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных.

В табл. 1 представлены данные о выживаемости и СПЖ погибших мышей при облучении ТСПП до и в пике Брэгга в диапазоне доз 4.5–15 Гр.

Гибель животных в обоих вариантах облучения протонами зависела от дозы и наблюдалась при всех исследованных дозах. После облучения в дозах 4.5 и 6.5 Гр, как до, так и в пике Брэгга, гибель мышей начиналась с 10-го дня, что свидетельствует о развитии костномозговой формы хронической лучевой болезни [11]. Гибель мышей, облученных протонами в пике Брэгга в дозах 8.5 Гр и выше, начиналась на 3–5-й день, что свидетельствует об индукции кишечной формы острой лучевой болезни, а при облучении до пика Брэгга такое течение болезни наблюдалось только после облучения в дозе 12.5 Гр, что сопровождалось падением веса животных на 23–27% перед гибелью.

После действия РИ в дозе 8.5 Гр более выражена была костномозговая форма лучевой болезни и 100% гибель наблюдалась к 14 сут в отличие от протонного излучения, после действия которого в пике Брэгга через 30 сут погибло 70%, а до пика – 67% мышей. СПЖ погибших от облучения мышей также была дозозависимой, но достоверных отличий между исследуемыми группами не наблюдалось.

Для определения величины дозы ЛД_50/30, при которой выживает 50% животных в течение месяца и которая является базовой радиобиологической характеристикой излучения, в качестве метода преобразования кривых смертности был использован пробит-анализ [12]. На рис. 1 представлены результаты пробит-анализа, на основании которого были вычислены значения ЛД_50/30: для ТСПП до пика Брэгга оно равнялось 7.2 Гр, в пике Брэгга – 6.6 Гр, а для РИ – 6.2 Гр.

Рис. 1.

Пробит-функция 30-суточной выживаемости мышей после воздействия ТСПП (а) до пика Брэгга (y = 7.3logD – 1.3); (б) в пике Брэгга (y = 6.3logD – 0.2); (в) рентгеновское излучение (y = 14.4logD – 6.4).

По критерию значений ЛД_50/30 была вычислена величина ОБЭ до и в пике Брэгга, которая составила 0.86 и 0.94 соответственно, статистически значимой разницы между величинами выявлено не было. Исходя из того, что полученные значения ЛД_50/30 лежали в диапазоне доз 6.2–7.2 Гр, для оценки ОБЭ по критерию 30 суточной выживаемости была выбрана доза 6.5 Гр.

Из рис. 2 видно, что, несмотря на то, что после облучения мышей в дозе 6.5 Гр протонами с разной ЛПЭ разница в динамике гибели животных несущественная, но к 30 сут в пике Брэгга их погибает 60%, а до пика – 36%. На основании этих результатов были рассчитаны значения коэффициентов ОБЭ при облучении мышей ТСПП в разных участках кривой Брэгга относительно РИ по интегральному показателю – площади под кривыми выживаемости животных в течение 30 сут. Коэффициент ОБЭ до пика Брэгга составил 0.84, а в пике – 0.83. Полученные значения согласуются с результатами ряда исследований определения ОБЭ по острым кожным реакциям мышей при облучении пучком протонов в пике Брэгга задней лапы и жесткого РИ, где величина ОБЭ находится в диапазоне 0.85–0.97 [13, 14]. Ранее нами было определено значение ОБЭ при общем облучении ТСПП мышей в пике Брэгга в дозе 1.5 Гр через 28 ч после воздействия по критерию цитогенетических нарушений в эритроцитах костного мозга, равное 1.15 [15]. Это значение также хорошо согласуется с данными, полученными на культурах клеток [16], и отражает раннюю радиочувствительность стволовых клеток костного мозга, одного из важнейших органов кроветворной и иммунной систем, обладающим огромным репопуляционным потенциалом. В данной работе по критерию выживаемости при облучении мышей в пике Брэгга значения ОБЭ были ниже и составили 0.83 и 0.94, что показывает отсроченную реализацию ответов всех чувствительных к облучению органов, обладающих быстроделящимися клетками, прежде всего костного мозга и желудочно-кишечного тракта. Кроме того, в нашей работе ОБЭ рассчитывалось относительно РИ с ЛПЭ, сопоставимой с ЛПЭ протонов в пике Брэгга, и ОБЭ которого по отношению к γ-излучению ⁶⁰Со равен 1.1–1.2 [17], поэтому полученные нами коэффициенты in vivo близки к значениям, принятым на данный момент в клиниках. Полученные нами результаты демонстрируют также зависимость значения ОБЭ от объекта, дозы, критериев регистрации повреждений и контрольного облучения, относительно которого высчитывается коэффициент.

Рис. 2.

Динамика гибели мышей после облучения ТСПП и рентгеновским излучением в дозе 6.5 Гр.

Используемая в нашей работе экспериментальная модель позволила определить величину ОБЭ несколькими способами на основе кривых выживаемости мышей в диапазоне доз, которые применяются также для оценки ОБЭ в условиях in vitro на культурах клеток млекопитающих. Ранее на других ускорителях с использованием пассивно-рассеянных пучков протонов разных энергий на животных были получены противоречивые данные о связи ЛПЭ с ОБЭ в отношении отдаленных последствий облучения [18]. В экспериментах на культурах и тканях млекопитающих при оценке краткосрочных эффектов протонов при аналогичных дозах было определено, что в низком диапазоне ЛПЭ 0.3–10 кэВ/мкм вели-чина ОБЭ протонов ниже или близка 1, и при 2–3-кратном увеличении ЛПЭ не наблюдается роста ОБЭ [19], в отличие от других ускоренных частиц, которые применяются в радиотерапии, ионов углерода и нейтронов, ЛПЭ которых значительно выше.

Таким образом, несмотря на близкие значения ОБЭ протонного излучения в разных областях кривой Брэгга, по динамике гибели мышей были выявлены резкие различия в развитии лучевой болезни в зависимости от дозы облучения, что свидетельствует о специфике повреждений критических систем и органов, индукции разнонаправленных компенсаторных механизмов, участвующих в формировании отдаленных реакций на тканевом и организменном уровне, приводящих в итоге к одинаковой гибели животных. В нашей работе при использовании нового способа доставки дозы протонов с помощью сканирования мишени баллистическим пучком частиц при облучении до и в пике Брэгга было показано, что ОБЭ по критерию выживаемости мышей близко к 1 и не зависит от ЛПЭ. Полученные данные позволят более широко использовать возможности нового комплекса “Прометеус” для ПТ, разработки и поиска новых радиопротекторов, а также корректировать радиационные риски от галактических космических лучей при длительных полетах.