1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 499, № 1, 2021

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 499, № 1, стр. 327-331

ОЦЕНКА ВЗАИМОСВЯЗИ УРОВНЯ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОДВИЖНОСТИ С ПРОЦЕССАМИ ПРОТЕОЛИЗА И ЛИМФОГЕННОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Е. Е. Середа 1, *, Е. С. Колегова 1, Г. В. Какурина 1, Е. А. Сиденко 1, Д. А. Коршунов 1, И. В. Кондакова 1

1 Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук
Томск, Россия

* E-mail: schaschovaee@oncology.tomsk.ru

Поступила в редакцию 27.02.2021
После доработки 29.03.2021
Принята к публикации 31.03.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Биологическая агрессивность опухоли определяется способностью опухолевых клеток к инвазии и метастазированию, что является следствием приобретения ими целого ряда фенотипических характеристик. Во время миграции клеток происходит ремоделирование актинового цитоскелета, которое осуществляется различными группами актин-связывающих белков, в регуляции которых важную роль играют протеасомы и кальпаины. Поэтому, изучение взаимосвязи белков, ассоциированных с клеточной подвижностью с процессами лимфогенного метастазирования, а также оценка регулирующей роли внутриклеточных протеаз в этих процессах чрезвычайно актуально для фундаментальной онкологии. В проведенном исследовании продемонстрированы ассоциации актин-связывающих белков с активностью протеасом и кальпаинов, характерные для опухолей и метастазов молочной железы, предложена возможная схема взаимосвязи внутриклеточных систем с актин-связывающими белками. Полученные результаты расширяют фундаментальные представления о процессах опухолевой прогрессии, а также могут быть использованы при поиске белков – мишеней для терапевтического воздействия при молекулярно–направленной терапии рака.

Ключевые слова: рак молочной железы, актин-связывающие белки, протеасомы, кальпаины, лимфогенные метастазы

Процесс метастазирования злокачественных опухолей связан с приобретением клетками подвижности, которая обеспечивается изменением экспрессионного профиля различных актин-связывающих белков и β-катенина. Во время миграции клеток происходит ремоделирование актинового цитоскелета, которое осуществляется различными группами актин-связывающих белков: мономер связывающие белки (тимозин-4β); филамент – деполимеризующие белки (кофилин); белки, разрывающие актиновые филаменты и формирующие два фрагмента (гельзолин); поперечносвязывающие белки, участвующие в формировании пучков филаментов, их ветвлении и формировании трехмерных структур (белки Arp2/3 комплекса) [1]. В этих процессах важную роль отводят и β-катенину, который в клетке присутствует в составе катенин-кадгериновых комплексов, обеспечивая адгезию и снижая миграционную активность клеток. С другой стороны, β-катенин является сигнальной молекулой в Wnt/β-катенин сигнализации, участвует в активации генной траскрипции посредством трансактивации TCF/LEF транскрипционных факторов, что приводит к повышению миграции, снижению адгезии и повышению пролиферации клеток [2]. По данным литературы, при анализе экспрессии генов, кодирующих актин-связывающие белки, было продемонстрировано их участие при опухолевой прогрессии и на этапах метастазирования [3]. Важная роль в регуляции активности локомоторных белков отводится протеасомам и кальпаинам, которые постоянно и с высокой скоростью утилизируют белки, выполнившие свою функцию, к числу которых относятся локомоторные белки [4, 5]. Протеасомы в клетке представлены мультикаталитическими мультисубъединичными комплексами и осуществляют протеолиз цитозольных, ядерных белков, превращение неактивных белков – предшественников в активные, участвуют в образовании регуляторных пептидов, презентации комплекса гистосовместимости I типа, регуляции транскрипции генов [6, 7]. Протеасомы проявляют каспазаподобную (КПА), трипсинподобную (ТПА) и химотрипсинподобную (ХПА) активность [8]. При обширном лимфогенном метастазировании рака молочной железы (РМЖ) наблюдается значительное угнетение активности протеасом, которое может считаться неблагоприятным прогностическим признаком [9–11]. Другая внутриклеточная протеолитическая система – кальпаиновая, представлена кальций-зависимыми цистеиновыми протеазами, которые осуществляют частичный протеолиз и часто поставляют субстрат для дальнейшей деградации белка протеасомами. Кальпаины могут выполнять посттрансляционную модификацию белков, увеличивая функциональное разнообразие белков – мишеней. Показано, что протеолитическая деградация характерна для β-катенина, кофилина, гельзолина и Arp2/3 комплекса [12, 13]. Протеолитическая регуляция актин-связывающих белков исследована недостаточно, несмотря на то, что этот процесс может быть одним из основных в реализации метастазирования злокачественных опухолей.

Целью настоящего исследования явилась оценка белков, ассоциированных с клеточной подвижностью при лимфогенном метастазировании РМЖ и изучение их взаимосвязи с активностью протеасом и кальпаинов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Всего в исследование было включено 73 пациентки с первично операбельным инвазивным РМЖ (Т1–3N1–2M0), комбинированное лечение которых было начато с хирургического этапа, включало проведение оперативного вмешательства, выполняемого в объеме радикальной мастэктомии или органосохранной расширенной операции. Возраст пациенток, вошедших в исследование, варьировал от 28 до 75 лет (средний возраст больных 56 ± 11 лет). У всех пациенток РМЖ диагноз был верифицирован морфологически. В представленной выборке у 71% пациенток было обнаружено от 1 до 3 метастатически-измененных регионарных лимфоузла, у 29% пациенток было обнаружено 4 и более метастатически-измененных регионарных лимфоузла. Материалом для исследования служили образцы неизмененной, опухолевой ткани, а также ткань лимфогенных метастазов, полученные при выполнении радикального оперативного вмешательства. Под неизмененной тканью подразумевали визуально неизмененную ткань молочной железы, взятую на расстоянии 1–3 см от границы опухоли. Опухолевая ткань и ткань лимфоузла проходили обязательную морфологическую верификацию. Содержание актин-связывающих белков – кофилина и тимозина – оценивалось методом Вестерн-блоттинг в осветленном гомогенате тканей. При этом проводилась стандартизация значений изучаемых белков на содержание β-актина. Результаты выражали в процентах от содержания изучаемых белков в неизмененной ткани (рис. 1). Содержание белков p45-Ser-β-катенин, Аrp3 и гельзолина оценивали методом проточной цитофлюориметрии в цитокератин 18-позитивных клетках. При этом оценивался процент клеток, экспрессирующих изучаемые показатели, по отношению ко всем цитокератин 18-позитивным клеткам.

Рис. 1.

Результаты Вестерн-блоттинг анализа содержания белков тимозин-4β и кофилина в тканях молочной железы: 1 – в неизмененной ткани; 2 – в опухолевой ткани; 3 – в ткани метастатических регионарных лимфоузлов.

Активность протеасом и кальпаинов в тканях РМЖ определяли в осветленных гомогенатах тканей по гидролизу соответствующих флуорогенных олигопептидов Suc-LLVY-AMС и Cbz-LLG-AMC (Sigma, США). Для оценки активности примесных протеаз применяли специфический ингибитор протеасом – MG132 (Sigma, США) и ингибитор кальпаинов – MG101 (Sigma, США). Активность протеасом и кальпаинов выражали в единицах активности на 1 мг белка (103 Ед/мг белка).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении содержания актин-связывающих белков в тканях пациенток РМЖ было показано, что уровень тимозина и кофилина достоверно выше в метастазах по сравнению с тканью первичной опухоли молочной железы. Содержание актин разрывающего белка гельзолина (который функционально схож с кофилином), уровень белка Аrp3, участвующего в связывании филаментов и входящего в состав Arp2/3 комплекса, а также содержание фосфорилированной по серину-45 фракции белка β-катенина не изменялось в метастазах по сравнению с первичной опухолью (табл. 1).

Таблица 1.

Процентное содержание актин-связывающих белков и p45-Ser β-катенина в ткани первичной опухоли и метастазах в регионарные лимфатические узлы у больных раком молочной железы

Изучаемый показатель, (%) Первичная опухоль Метастазы в регионарные лимфоузлы p
Тимозин-4β 19.0 [12.0; 23.0] 56.0 [32.5; 94.5] p = 0.001
Кофилин 19.0 [14.0; 23.0] 152.0 [55.0; 237.0] p = 0.0009
p45-Ser β-катенин 74.5 [29.0; 90.0] 77.0 [69.0; 93.0] p > 0.05
Аrp3 34.0 [27.0; 64.0] 47.0 [43.0; 56.0] p > 0.05
Гельзолин 58.0 [33.0; 77.0] 72.0 [56.0; 77.0] p > 0.05

Таким образом, продемонстрировано различие в уровне мономер связывающего белка тимозина-4β и филамент-деполимеризующего белка кофилина между тканью первичной опухоли и лимфогенными метастазами рака молочной железы.

В настоящее время различные аспекты влияния протеасом и кальпаинов на приобретение злокачественными клетками способности к метастазированию не в полной мере освещены в литературе, и, несомненно, нуждаются в дальнейшем изучении. Поэтому следующим этапом проведенного исследования явилось изучение активности внутриклеточных протеолитических систем в тканях РМЖ и их дальнейшее сопоставление с содержанием актин-связывающих белков в опухолевой ткани и лимфогенных метастазах при раке молочной железы.

При изучении активности протеасом и кальпаинов в тканях больных РМЖ выявлено усиление процессов внутриклеточного протеолиза в опухоли и ткани лимфогенных метастазов по сравнению с неизмененными тканями. В опухоли продемонстрировано статистически значимое увеличение ХПА в 2.4 раза, КПА в 2.7 и активности кальпаинов (АК) в 1.9 раза соответственно, по сравнению с неизмененной тканью. В ткани метастатически измененных регионарных лимфоузлов наблюдалось увеличение ХПА в 3.6 раза и КПА в 2.5 раза по сравнению с неизмененной тканью. Кроме того, для ХПА было зарегистрировано статистически значимое увеличение в ряду: “неизмененная ткань – опухоль – лимфогенные метастазы” (р = 0.04). КПА протеасом и активность кальпаинов в опухоли были сопоставимы с активностью в лимфоузлах (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение активности протеасомной и кальпаиновой внутриклеточных протеолитических систем в неизмененной, опухолевой ткани и ткани метастатически измененных регионарных лимфатических узлов при раке молочной железы

Активность внутриклеточных протеаз Неизмененная ткань Опухолевая ткань Метастазы в регио- нарные лимфоузлы
ХПА 16.33 [8.22; 35.75] 39.66* [19.16; 80.90] 59.52*,** [29.39; 148.69]
КПА 17.2 [9.68; 40,01] 46.0* [19.57; 146.63] 43.63* [16.54; 110.95]
АК 34.95 [20.09; 128.57] 66.08* [32.30; 158.70] 59.40 [22.10; 185.90]

Примечание: * – значимость различий с группой неизмененная ткань, р < 0.01; ** – значимость различий с группой опухолевая ткань, р < 0.05.

Далее было проведено сопоставление активности внутриклеточных протеаз с содержанием актин-связывающих белков в опухолевой ткани и лимфогенных метастазах при раке молочной железы (рис. 2).

Рис. 2.

Корреляционные взаимосвязи между актин-связывающими белками, фракциями β-катенина, активностью протеасом и кальпаинов.

Примечание: ХПА – химотрипсинподобная активность протеасом; КПА – каспазаподобная активность протеасом; АК – активность кальпаинов; R – коэффициент корреляции Спирмена; – обратная корреляционная взаимосвязь; – прямая корреляционная взаимосвязь. р – уровень статистической значимости показателя.

Выполненный корреляционный анализ показал, что в ткани рака молочной железы наблюдается отрицательная корреляционная зависимость между содержанием кофилина и другими актин-связывающими белками (тимозин-4β, гельзолин, Arp3 и p45-Ser β-катенин), а также прямые взаимосвязи между p45-Ser-β-катенином, который регулирует адгезивные и миграционные способности клеток, и ХПА протеасом. На основе результатов корреляционного анализа нами предложена возможная схема взаимосвязи протеасомной, кальпаиновой внутриклеточных систем с актин-связывающими белками. Для ткани метастатических лимфоузлов выявлена взаимосвязь P45-Ser-β-катенина и гельзолина с ХПА и КПА протеасом опухолевой ткани, тогда как содержание кофилина в метастазах прямо коррелировало с АК в опухоли, которые являются протеазами-модуляторами и часто поставляют субстрат для дальнейшей деградации белка протеасомами (рис. 2).

Вероятно, для опухолей молочной железы характерен протеолиз p45-Ser-β-катенина, скорее всего, конъюгированного с полиубиквитином, 26S протеасомой либо гибридной формой протеасом, что согласуется с представлениями о неканоническом пути регуляции стабильности молекул β-катенина через убиквитин-протеасомную систему [14]. А прямая корреляционная зависимость активности кальпаина в опухоли с содержанием деполимеризующего белка кофилина в метастазах может быть связана со способностю кальпаинов расщеплять адгезионные межклеточные контакты, которые способствуют выходу клеток в регионарные лимфоузлы [15]. Полученные результаты расширяют фундаментальные представления о процессах метастазирования злокачественных опухолей.

Список литературы

  1. dos Remedios C.G., Chhabra D., Kekic M., et al. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments (Review) // Physiol. Rev. 2003. V. 83. № 2. P. 433–473.

  2. Guo X., Wang X., Wang Z., et al. Site-specific proteasome phosphorylation controls cell proliferation and tumorigenesis // Nat. Cell. Biol. 2016. V. 18. № (2). P. 202–212.

  3. Какурина Г.В., Кондакова И.В., Спирина Л.В., и др. Экспрессия генов, кодирующих белки клеточной подвижности, в развитии плоскоклеточного рака головы и шеи // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018. Т. 166. № 8. С. 209–212.

  4. Islam S.M.-A., Patel R., Bommareddy R.R. The modulation of actin dynamics via atypical protein kinase-C activated cofilin regulates metastasis of colorectal cancer cells // Cell. Adh. Migr. 2018. № 10. P. 1–15.

  5. Del Carmen Lafita-Navarro M., Conacci-Sorrell M. Identification of calpain-activated protein functions // Methods Mol. Biol. 2019. V. 1915. P. 149–160.

  6. Степанова А.А., Люпина Ю.В., Шарова Н.П. и др. Нативная структура иммунных протеасом печени крыс // Доклады Академии наук. 2016. Т. 468. № 3. С. 339–341.

  7. Collins G.A., Goldberg A.L. The logic of the 26S proteasome // Cell. 2017. V. 169. № 5. P. 792–806.

  8. Jung T., Grune T. Structure of the proteasome // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2012. V. 109. P. 1–39.

  9. Шашова Е.Е., Астахова Т.М., Плеханова А.С., и др. Изменение химотрипсинподобной активности протеасом в развитии карцином молочной и щитовидной желез человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. № 8. С. 209–211.

  10. Шашова Е.Е., Кондакова И.В., Слонимская Е.М., и др. Изменение химотрипсинподобной и каспазоподобной активностей протеасом в зависимости от степени распространенности рака молочной железы // Сибирский онкологический журнал. 2013. № 5. С. 45–49.

  11. Шашова Е.Е., Колегова Е.С., Завьялов А.А., и др. Изменение активности протеасом и кальпаинов при метастазировании рака легкого и рака молочной железы человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2017. Т. 163. № 4. С. 486–489.

  12. Shortrede J.E., Uzair I.D., Neira F.J., et al. Paxillin, a novel controller in the signaling of estrogen to FAK/N-WASP/Arp2/3 complex in breast cancer cells // Mol Cell Endocrinol. 2016. V. 430. P. 56–67.

  13. Molinie N., Gautreau A. The Arp2/3 regulatory system and its deregulation in cancer // Physiological Reviews. 2018. V. 98. № 1. P. 215–238.

  14. Shang S., Hua F., Hu Z.W. The regulation of β-catenin activity and function in cancer: therapeutic opportunities // Oncotarget. 2017. V. 8. № 20. P. 33972–33989.

  15. Carragher N.O. Assaying calpain activity // Methods Mol. Biol. 2007. V. 370. P. 109–120.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал