Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 499, № 1, стр. 317-321

Hyssopus L. – род многолетних трав или полукустарников [1], включающий, согласно “The Plant List” 7 видов и 3 подвида [2], которые естественным образом распространены в Южной Европе, Центральной Азии и Северной Африке [3]. В коллекциях ex situ иссоп (Hyssopus officinalis L.) в основном широко используется как ароматическое растение. Кроме того, благодаря ветрогонному, месячногонному, стимулирующему, дигестивному и тонизирующему действию растения иссопа используются в медицине. Компоненты, которые способствуют его целебным свойствам, включают: эфирное масло, состоящее в основном из пинокамфона, изопинокамфона, пиненов, камфена и терпенина; гликозид иссопин, дубильные вещества, флавоноиды, изолиновую кислоту, олеоноловую кислоту, маррубин, а также смолу и камедь [4]. Иссоп является декоративным компонентом и, имея длительный период цветения и разнообразие окраски лепестков, применяется в ландшафтном дизайне [5, 6].

Традиционно иссоп размножают семенами [7], однако этот способ имеет некоторые ограничения для перспективных форм и сортов [8]. Увеличение количества клонов путем вегетативного размножения ограничивается слабым развитием корневой системы и высокой травматичностью полукустарников при разделении [9]. Размножение зелеными черенками, в зависимости от генотипа, также имеет определенные трудности при укоренении. Но данный тип размножения важен для сохранения продуктивных форм и сортов, а также для интенсификации производства необходимого количества посадочного материала. Биотехнологические методы в настоящее время позволяют массово размножить, изучить и сохранить полученные ценные единичные селекционные формы [10]. В Никитском ботаническом саду разработан эффективный метод регенерации in vitro растений иссопа и его форм из вегетативных органов и тканей, исключающий этап каллусогенеза [11]. Считается, что размножение растений in vitro указанным выше способом позволяет получить регенеранты, которые генетически идентичны материнским растениям [12]. Однако, согласно литературным данным, использование определенных концентраций регуляторов роста в питательной среде может привести к возникновению мутаций и генетической нестабильности [13]. Следовательно, для размножаемого ценного посадочного материала in vitro очень полезна оценка генетической близости [14].

Для исследования были взяты растения Hyssopus officinalis L. (сорт Никитский Белый), культивируемые ex situ на коллекционном участке Никитского ботанического сада. В качестве эксплантов использовали сегменты побега с узлом, которые стерилизовали последовательно в 70%-ном растворе этанола (1 мин), 1%-ном растворе тимеросала (10 мин), 0.3% растворе препарата “Дез ТАБ” (15 мин) и переносили на модифицированную питательную среду Mурасиге и Скуга (МС) [15], содержащую половинный набор макро-, и микросолей, полный состав витаминов, 30 г/л сахарозы, 9.0 г/л агара, 0.5–1.0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0.1 мг/л β-индолилмасляной кислоты (ИМК). Контрольной была среда МС без регуляторов роста. Последующие субкультивирования проводили на питательной среде МС того же состава с 0.3–0.9 мг/л БАП. Питательные среды автоклавировали в паровом стерилизаторе LAC 5060S (Daihan Labtech, Южная Корея) при 120°С в течение 10 мин. Регуляторы роста, витамины пропускали через шприцевой фильтр (TPP, Switzerland) c диаметром пор 0.22 мкм и добавляли в питательные среды после автоклавирования. Субкультивирование на свежие питательные среды проводили каждые 3 нед. Экспланты в культуральных сосудах содержали в фитокапсуле Уникальной научной установки “ФИТОБИОГЕН” ФГБУН “НБС-ННЦ” или климатической камере MLR-352-PE (Panasonic, Япония) при температуре 24 ± 1°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивности освещения 37.5 мкM м^–2 с^–1 под холодным белым светом люминесцентных ламп (Philips TL, Япония). Весь срок культивирования in vitro составил 6 мес.

ДНК выделяли из листьев 5 побегов растений ex situ и адвентивных микропобегов in vitro на образец с применением одного из классических способов с цетилтриметиламмоний бромидом (2 × ЦТАБ) [16] и 2%-м поливинилпирролидоном (ПВП). ПЦР проводили с использованием праймеров OPA1 5'-CAGGCCCTTC-3', OPA2 5'-TGCCGAGCTG-3', OPA3 5'-AGTCAGCCAC-3', OPA4 5'-AATCGGGCTG-3' (RAPD-анализ) и UBC807 5'-(AG)₈T-3', UBC818 5'-(CA)₈G-3', UBC836 5'-(AG)₈YA-3', GR215 5'-(CA)₆GT-3', HB12 5'-(CAC)₃GC-3', X10 5'-AGC(ACG)₅C-3' (ISSR-анализ) в термоциклере C1000™ (Bio-Rad, Сингапур). Условия реакции были следующими: начальная денатурация – 95°C – 5 мин, денатурация – 95°C – 15 с, отжиг – 36 и 45°C (RAPD и ISSR-анализ) – 20 с, элонгация – 72°C – 1 мин, итоговая элонгация – 72°C – 10 мин (40 и 45 циклов соответственно). В качестве молекулярного маркера использовали Step 100 Long (Биолабмикс, РФ). Амплифицированные фрагменты анализировали при помощи горизонтального электрофореза в 1.7% агарозном геле с буфером 0.5 × TBE при 85 В в течение 1 ч с использованием универсального источника питания PowerPac™ (BioRad, Сингапур). Гель визуализировали с помощью системы документации E-box (Vilber Lourmat, Франция) и обрабатывали в программном обеспечении Image Lab™ версии 6.0 (Bio-Rad, США). Эксперимент повторяли дважды, анализировали воспроизводимые полосы. Данные обрабатывали статистически с применением программного обеспечения Past [17].

Индуцирующими факторами развития эксплантов при культивировании in vitro являются тип и концентрация регуляторов роста в питательной среде [18]. Инициацию развития вегетативных почек иссопа in vitro на среде МС, дополненной 0.5–1.0 мг/л БАП и 0.1 мг/л ИМК, наблюдали на 8–10-е сутки культивирования (рис. 1).

Рис. 1.

Этапы регенерации in vitro иссопа из сегментов узла на модифицированной среде МС, дополненной БАП: a – инициация развития микропобега на первичном экспланте; б – формирование микропобегов; в – множественное образование микропобегов; г – спонтанный ризогенез.

Через 15 сут отмечали образование первых листьев. Через 21 сут культивирования формировался микропобег, в листовых пазухах которого закладывались аксиллярные почки. Наличие в среде БАП способствовало их развитию и образованию микропобегов второго порядка, которые отделяли и субкультивировали на среде МС, дополненной 0.3–0.9 мг/л БАП. Для оценки регенерационного потенциала микропобегов иссопа в культуре in vitro было проанализировано их число на эксплант (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние различных концентраций БАП в питательной среде МС на регенерацию микропобегов Hyssopus officinalis сорта Никитский Белый in vitro.

Оптимальная концентрация БАП установлена на уровне 0.5 мг/л, при этом получено 3.3 ± 0.16 нормально сформированных микропобегов на эксплант. Присутствие в среде 0.7–0.9 мг/л БАП способствовало увеличению количества микропобегов до 4.5 ± 0.18 штук, при этом среди нормально сформированных органов и их структурных частей отмечали наличие различных морфологических изменений, таких как деформация, утолщение, срастание микропобегов, образование единичных непропорциональных листьев. Наличие в среде 0.3–0.4 мг/л БАП способствовало росту и удлинению микропобегов, их спонтанному укоренению, однако отмечали снижение интенсивности побегообразования.

Исследование генетической близости проводили между растениями, культивируемыми ex situ и регенерантами in vitro. Для скрининга использовали 4 праймера RAPD и 6 праймеров ISSR (рис. 3).

Рис. 3.

Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами RAPD (а), ISSR (б) и ДНК, выделенной из листьев растений Hyssopus officinalis сорта Никитский Белый, культивируемых ex situ (1) и in vitro (2). М – маркер, по – пары оснований.

Все исследованные праймеры давали воспроизводимые полосы. Количество последних для RAPD и ISSR-маркеров варьировало от 6 (OPA3) до 10 (OPA1) и от 2 (UBC807) до 8 (GR215) соответственно. RAPD праймеры образовывали ампликоны в диапазоне от 260 пн (OPA2) до 3000 и более пн (OPA2), при этом длина продуктов амплификации в ISSR-PCR была меньше и варьировала в пределах от 250 по (HB12) до 1750 по (X10). Наши результаты показали, что праймеры продуцировали ампликоны, которые были мономорфными для всех исследованных растений ex situ и in vitro, полиморфизм между ними не обнаружен.

Процессы, протекающие при культивировании тканей in vitro, во многом регулируются компонентами питательной среды, их концентрацией и соотношением, а также другими механическими, физическими и химическими факторами [19, 20]. Регуляция процесса морфогенеза in vitro с помощью цитокининов и ауксинов лежит в основе клонального микроразмножения растений [18, 19]. На этапе множественного побегообразования необходимо стимулировать активно протекающие процессы дифференцировки вновь образуемых морфогенных структур. Чаще всего для этих целей используют питательные среды одного состава, изменяя концентрацию регуляторов роста. Наши результаты показали, что культивирование in vitro эксплантов иссопа на среде МС с добавлением 0.5 мг/л БАП способствовало формированию побегов без визуальных морфологических изменений, а также спонтанному укоренению, что исключало отдельный этап ризогенеза. Увеличение концентрации БАП наряду с ростом числа микропобегов способствовало появлению аномалий у органов растений, что может быть вызвано составом питательной среды, и ее влиянием на гистологию и анатомию образованных структур. Это вполне согласуется с данными литературы [4].

Сходство регенерантов, полученных in vitro, в первую очередь оценивается по морфологическим и анатомическим признакам, однако важнейшим является их генетический анализ. Наши исследования подтвердили, что клоны иссопа, полученные из пазушных почек, были идентичны материнским растениям, что согласуется с литературой [14], и свидетельствует об определенной генетической стабильности данного материала при субкультивировании in vitro на питательных средах c регуляторами роста.

Таким образом, полученные результаты четко показали, что регенерация in vitro H. officinalis сорта Никитский Белый из cегментов побега с узлом на модифицированной среде MС с добавлением 0.5 мг/л БАП и 0.1 мг/л ИМК позволила получить регенеранты/клоны с нормальной морфологией, генетически идентичные материнским растениям ex situ, что очень важно для разработки биотехнологических приемов массового тиражирования ценных генотипов, сортов и селекционных форм растений.