Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 500, № 1, стр. 474-477

Общепризнано, что иминокислота пролин является уникальным фактором устойчивости растений к действию разнообразных абиотических и биотических стрессоров. Первоначально сильное повышение содержания пролина под влиянием обезвоживания было обнаружено у проростков райграса [1] и под влиянием почвенной засухи – в листьях, стеблях и колосьях пшеницы [2]. Если в первой работе накопление пролина объяснялось усилением его синтеза, то во второй – его освобождением при деградации белков. В дальнейшем было опубликовано множество экспериментальных и обзорных статей, посвященных различным аспектам пролинологии, и подтверждена роль пролина в повышении устойчивости растений. В большинстве работ повышение содержания пролина объясняли активацией ферментов его синтеза из глутамата и орнитина, что подтверждалось использованием трансгенных растений с усиленной экспрессией генов этих ферментов [3]. После обнаружения и исследования белков, обогащенных пролином (БОП), а также ферментов пролин-иминопептидаз, способных осуществлять депролинизацию БОП, стали допускать возможность накопления пролина за счет деградации БОП.

“Пролинологи” отмечают, что роль и функции пролина в адаптации растений к неблагоприятным условиям до сих пор остаются неясными и загадочными [3]. В значительной степени это связано со многими путями синтеза, деградации и использования свободного пролина, их зависимости от силы и продолжительности воздействия одного стрессора или последовательности действия нескольких стрессоров, участия в регуляции пролинового метаболизма фитогормонов и эндогенных ключевых факторов фитоиммунитета.

Одним из таких факторов является монооксид азота (NO), быстро образующийся и накапливающийся в тканях растений при их инфицировании микроорганизмами и вызывающий защитное перепрограммирование экспрессии генов [4]. Необходимо отметить, что ответ на действие NO исследовался в основном на надземных органах растений, но известно, что NO образуется эндогенно и в корнях при действии на них патогенов. Следует также учитывать, что корни могут подвергаться действию экзогенного NO, продуцируемого почвенными микроорганизмами [5]. Учитывая все это, мы поставили перед собой задачу исследовать ответ корней на действие NO с помощью протеомного анализа.

8-дневные проростки гороха Pisum sativum L. сорт Тан, выращенные на ¼ питательной среды Хогланда–Арнона, помещались корнями в среду роста, содержащую донор NO – нитропруссид Na (150 мкМ). Обработку проводили в течение 72 ч, с ежедневной сменой растворов. Контролем служили растения, не обработанные нитропруссидом Na. Выделение растворимых белков корней гороха и двумерный электрофорез проводили по методике, использованной в нашей ранее опубликованной работе [6]. Разделение белков осуществляли на стрипах с иммобилизованным градиентом pH 4–7, 17 см (Bio-Rad, США). Для выявления белков, содержание которых изменялось под влиянием донора NO, двумерные электрофореграммы анализировали с помощью программы PDQuest 8.1 (Bio-Rad, США). Использовали по три контрольных и обработанных нитропруссидом Na гелей, каждый из которых представлял биологическую повторность. Идентифицировали только белки, содержание которых повышалось более чем в 1.5 раза. Анализ полученных после трипсинолиза пептидов проводили с помощью HPLC-MS/MS масс-спектрометрии на приборе MicrOTOF-Q (Bruker, Германия) с последующим поиском возможных совпадений по MS BLAST, описанным в работе [6]. Анализ первичной структуры белков осуществляли на сервере NCBI.

Содержание пролина в корнях проростков гороха определяли по методу Bates с модификациями [7].

Среди белков, индуцируемых нитропруссидом Na в корнях гороха, была выявлена пролин-иминопептидаза (ПИП), имеющая молекулярную массу 44.7 кДа и pI 5.83. Анализ двумерных электрофореграмм растворимых белков корней гороха показал, что содержание белка под влиянием донора NO повышалось почти в 3 раза (рис. 1).

Рис. 1.

Фрагменты двумерных электрофореграмм растворимых белков корней гороха. Показан участок геля, содержащий белок, идентифицированный как пролин-иминопептидаза в контрольных (К) и обработанных нитропруссидом Na (Нп-Na) корнях.

Выявленная нами ПИП корней гороха была идентифицирована по гомологии с белком XP_004485649.1 нута [Cicer arietinum], с которым совпали 4 пептида, полученные после трипсинолиза. Был проведен поиск BLAST аминокислотной последовательности в базе данных белков гороха https://urgi.versailles.inrae.fr/blast/ и найдена последовательность белка Psat1g212200.1, содержащая идентифицированные пептиды и имеющая 80% гомологии с белком XP_004485649.1 из нута. ПИП гороха состояла из 395 аминокислотных остатков.

Рис. 2.

Аминокислотная последовательность белка Psat1g212200.1, идентифицированного нами как пролин-иминопептидаза. Жирным шрифтом выделены идентифицированные пептиды. Цветным выделением (желтым) обозначены консервативные аминокислоты, содержащие S-D-H каталитическую триаду.

Идентифицированная нами ПИП относится к суперсемейству альфа/бета гидролаз, семейству пролин-иминопептидаза подобных белков (сериновых экзопептидаз S33). Согласно базе данных пептидаз MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops /cgi-bin/famsum?family=S33), для активности этого  фермента  важна  каталитическая  триада S-D-H (серин-аспарагиновая кислота-гистидин), содержащая консервативный остаток серина S в последовательности GxSxG (у ПИП гороха S находится в 184 положении). ПИП обладает узкой субстратной специфичностью и отщепляет лишь концевой остаток пролина от полипептидной цепи обогащенных пролином и оксипролином белков. ПИП являются в значительной степени консервативными практически для всех организмов, и, согласно MEROPS, во многих организмах с секвенированными геномами представлены одной или двумя изоформами.

Наш анализ показал, что ПИП корней гороха не имеет транспортного сигнального пептида и, в связи с этим, или функционирует внутри клеток, или его перенос в апопласт осуществляется с помощью неклассического механизма [8]. Неклассическому типу транспорта в последнее время уделяется большое внимание, так как получены факты его связи с защитным ответом клеток [9].

Полученная нами информация об NO-индукции ПИП в корнях свидетельствует о возможности вызванной этим активации депролинизации БОП и накопления свободного пролина. Действительно, мы обнаружили, что нитропруссид Na повышает содержание пролина в корнях гороха в 1.6 раза. Это дополняет еще одной возможной причиной полученные ранее данные о повышении содержания пролина у растений под влиянием NO за счет активации его синтеза [10], а также мнение о том, что гомеостаз пролина тонко регулируется его синтезом, деградацией и транспортом [11].

К БОП относятся, главным образом, компоненты клеточных стенок, которые подразделяются на несколько обширных семейств [12]: наиболее гликозилированные белки – экстенсины; арабиногалактановые белки; собственно БОП; гибридные белки, содержащие не только пролиновые домены, но и консервативные последовательности аминокислот, характерные, главным образом, для липид-переносящих белков; небольшие (менее 200 аминокислот) арабинозилированные белки.

БОП клеточных стенок обладают видо-, органо- и тканеспецифичностью [13] и отличаются большим многообразием. Например, экстенсины и арабиногалактановые белки включают в себя более 100 форм.

Не имеется информации, какие формы БОП являются мишенями ПИП, подобных идентифицированной нами. Это относится и к случаям с использованием трансгенных растений с усиленной экспрессией ПИП, для которых были характерны накопление пролина и повышение устойчивости к неблагоприятным факторам [14–16]. Не исключено, что некоторые формы БОП представляют собой своеобразные хранилища пролина и способны освобождать его с помощью ПИП, индуцируемых при действии стрессоров.

Мишенью ПИП растений не могут быть все виды БОП, так как их депролинизация и связанный с ним протеолиз должны были бы отрицательно сказаться на осуществлении барьерной функции клеточных стенок. О важности этой функции в защите растений от патогенов можно судить по фактам продукции ПИП патогенными микроорганизмами для разрушения БОП клеточных стенок растений. Более того, установлено, что ПИП являются факторами вирулентности фитопатогенных бактерий и грибов [17, 18].

Полученные нами данные свидетельствуют о возможном участии в NO-индуцируемом накоплении пролина не только активации его синтеза [10], но и депролинизации БОП.