Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 501, № 1, стр. 522-527

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена в осенне-зимний период на половозрелых крысах-самцах Вистар (n = 60) с исходной массой тела 180–200 г. Животных содержали по 10 особей. ПТСР воспроизводили, используя общепризнанную модель предаторного стресса – эволюционно закрепленного, избирательного страха грызунов перед хищником и его запахом, разработанную Hagit Cohen и Joseph Zohar и усовершенствованную Vadim Tseilikman и соавт. [5, 6]. В работах Vera Voznessenskaya и соавт., а также Raimund Apfelbach и соавт. показано, что воздействие запаха хищника настолько значительно для грызунов, что активирует не только поведенческий рефлекс – бегство, но и абортивную реакцию у беременных самок [7–9]. Были сформированы 2 группы: 1-я – интактные крысы (n = 20); 2-я – животные, подвергаемые предаторному стрессу (кошачья моча) по 10 мин в течение 10 сут с последующим содержанием в течение 14 сут в обычных условиях (ПТСР) (n = 40). Все экспериментальные процедуры проводили согласно требованиям “Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных” (1984) и в соответствии с директивой Европейского парламента 2010/63/EU“О защите животных, используемых в экспериментальных целях” (от 22.09.2010).

Для выявления поведенческих проявлений развития ПТСР, животных в конце эксперимента тестировали в течение 10 мин (600 с) в “Приподнятом крестообразном лабиринте” (ПКЛ). Вычисляли   разработанный H. Cohen и соавт. индекс тревожности (ИТ), по формуле: ИТ = 1 – – [(ВОР/ВТ + ЧЗОР/ОЧЗ)/2], где ВОР – время нахождения в открытых рукавах ПКЛ, ВТ – время тестирования в с, ЧЗОР – число заходов в открытые рукава, ОЧЗ – общее число заходов в рукава [10].

Крыс выводили из эксперимента передозировкой золетила. Левые надпочечники фиксировали в жидкости Буэна, заливали в парафин. Гистологические экваториальные срезы надпочечников толщиной 4–5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. При помощи морфометрической программы AxioVision на микрофотографиях, полученных с помощью микроскопа Axioplan 2 imaging, производили на каждом срезе 10 измерений толщины функциональных зон коркового вещества и диаметра кариона эндокриноцитов. Рассчитывали индекс функциональной активности адренокортикоцитов каждой зоны по формуле: ИФА = (ТФЗ * СДК)/100, где ТФЗ – толщина функциональной зоны, СДК – средний диаметр кариона, рассчитанный по формуле: $\sqrt {{\text{Макс}}} *{\text{Мин}}$ [11].

В сыворотке крови крыс методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли уровень кортикостерона “IBL” (Германия) и тестостерона DBC (Канада), используя иммуноферментный анализатор ANTHOS (Австрия).

Сравнение экспериментальных групп производили при помощи ANOVA, критерия Краскела–Уоллиса для множественных сравнений, U-критерия Манна–Уитни для парных сравнений. Результаты выражали как Me (Qн; Qв) – медиана, нижний и верхний квартили. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общеизвестно, что ПТСР развивается далеко не у всех субъектов (людей и животных), подвергавшихся одинаковому стрессу [1, 2]. При тестировании крыс в ПКЛ установлено, что по сравнению с контрольными и устойчивыми к стрессу крысами, неустойчивые особи характеризовались более выраженным анксиогенным эффектом, проявляющимся в снижении времени нахождения в открытых рукавах ПКЛ, числа заходов в них и локомоторной активности (табл. 1). Показатели устойчивых к стрессу особей отличались от контрольных лишь по времени нахождения в открытых рукавах ПКЛ, которые, так же, как и у неустойчивых крыс, уменьшались, однако были в 5.6 раза выше, чем у низкоустойчивых особей. Правомерность фенотипирования популяции, в дополнение к вышеуказанным показателям, подтверждалась интегральным параметром – индексом тревожности, который был достоверно значимо повышен у неустойчивых к стрессу животных, тогда как значения этого параметра устойчивых особей не отличались от контроля (табл. 1).

Сравнение содержания кортикостерона и тестостерона в сыворотке крови продемонстрировало снижение содержания определяемых гормонов у всех стрессированных крыс (табл. 1). Снижение уровня кортикостерона является общепризнанным показателем развития ПТСР-подобного состояния [6, 10, 12, 13]. Тем не менее значения содержания кортикостерона у высокоустойчивых крыс были достоверно значимо выше, чем у неустойчивых (табл. 1). В нашем предыдущем эксперименте, было установлено, что еще до моделирования стресса крысы, оказавшиеся впоследствии неустойчивыми к стрессу, характеризовались более высоким уровнем кортикостерона. Удалось определить, что у устойчивых к стрессу животных преобладает цитохром P4503A-зависимый метаболизм глюкокортикоидов, а у неустойчивых – зависящий от 11β-гидроксистероиддегидрогеназы типа 2 [13].

Уровень тестостерона уязвимых особей оказался наиболее низким (табл. 1). Аналогичное снижение уровня тестостерона отмечено у комбатантов при диагностировании выраженного ПТСР [14, 15]. Кроме того, снижение уровня тестостерона – основного анаболического гормона, обычно связано с риском развития ишемической болезни сердца и другими заболеваниями сердечно-сосудистой системы [16, 17].

Необходимо акцентировать внимание на снижении интегрального показателя отношения уровня тестостерона к уровню кортикостерона у неустойчивых к стрессу животных (табл. 1). Последнее свидетельствует о преобладании у неустойчивых крыс катаболических процессов над анаболическими, что при дополнительных факторах риска чревато сбоем работы функциональных систем. В то же время этот показатель у высокоустойчивых особей не отличался от контроля (табл. 1).

Анализируя морфологическое состояние коркового вещества надпочечников, которое отражает статус гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, установлено, что после развития ПТСР-подобного состояния у всех стрессированных крыс отмечено уменьшение толщины коркового слоя надпочечников на 46.1–44.3%, происходящее в основном за счет сокращения толщины пучковой на 48.1–50.2% и сетчатой на 43.9–50.1% зон (табл. 2). При этом интегральный показатель – индекс функциональной активности клеток (ИФАК) этих зон значительно снижался при моделировании ПТСР (табл. 2). В то же время ИФАК пучковой зоны устойчивых крыс был достоверно значимо выше, чем уязвимых, тогда как значения ИФАК сетчатой зоны этих особей были сходны (табл. 2). Тем не менее более масштабные морфофункциональные трансформации наблюдались у неустойчивых к стрессу животных, у которых, в дополнение к указанным изменениям, обнаружено более существенное по сравнению с контролем и устойчивыми крысами уменьшение толщины клубочковой зоны – на 18.2 и 14.4% соответственно, сопровождающееся наименьшими показателями ИФАК этой зоны (табл. 2). Тогда как показатели ИФАК клубочковой зоны устойчивых крыс были самыми высокими, превышая контрольные значения на 24 и 29.2% – значения неустойчивых к стрессу особей (табл. 2).

В 1994 г. группой японских исследователей была идентифицирована и охарактеризована новая зона надпочечников крыс, расположенная между клубочковой и пучковой зонами, и названная “камбиальной зоной” [18]. В последующих работах было показано, что клетки этой зоны являются стволовыми клетками, поддерживающими клеточный состав клубочковой и пучковой зон [19]. В нашем исследовании толщина камбиальной зоны неустойчивых особей оставалась на уровне контрольных величин, тогда как у устойчивых к стрессу крыс зарегистрировано очень значительное увеличение толщины камбиальной зоны, превышающее контрольные значения на 89.5 и 77.1% – неустойчивых животных (табл. 2). При этом интегральный показатель – ИФАК камбиальной зоны устойчивых к стрессу крыс оказался наибольшим среди всех групп, он превосходил контрольные значения в 2.5 раза и в 2.7 раза – значения уязвимых животных. Вероятнее всего увеличение толщины камбиальной зоны и возрастание ИФАК устойчивых особей отражают существенную активацию адаптационных процессов гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.

Как известно, снаружи надпочечник заключен в фиброзную капсулу, состоящую из пучков коллагеновых и эластических волокон, нескольких слоев фиброцитов и гладкомышечных клеток, идущих параллельно наружной поверхности железы. Считается, что в капсуле надпочечника находятся стволовые/прогениторные клетки, которые способны давать начало гонадоподобным клеткам и производить половые стероиды [16]. При моделировании ПТСР в нашем эксперименте толщина капсулы надпочечников устойчивых и неустойчивых к стрессу крыс уменьшалась по сравнению с контролем. Тем не менее следует подчеркнуть, что толщина капсулы уязвимых к стрессу крыс была на 43.4% меньше устойчивых. Возможно, свойством стволовых/прогениторных клеток капсулы производить половые стероиды объясняется более высокий уровень тестостерона у высокоустойчивых особей, чем у неустойчивых.

Таким образом, в проведенном исследовании впервые удалось обнаружить персонифицированные морфофункциональные различия надпочечников устойчивых и неустойчивых к предаторному стрессу крыс Вистар. Несмотря на выраженные признаки дисфункции адреналовых желёз у обоих фенотипов, утолщение камбиальной зоны и высокие значения индекса функциональной активности стволовых клеток этой зоны у устойчивых особей, позволяют сделать вывод о том, что у этих животных наблюдается восстановление морфофункционального состояния надпочечников, т.е. продуктивная адаптация. Приоритетными являются данные о непосредственной связи между снижением уровня кортикостерона и тестостерона с надпочечниковой недостаточностью при моделировании ПТСР. Полученные в работе сведения позволяют рассматривать стволовые клетки надпочечников в качестве потенциальных терапевтических мишеней.