Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 501, № 1, стр. 551-556

Плазминоген/плазмин функционирует как наиболее важная внеклеточная протеазная система in vivo, вовлекаясь в целый ряд патофизиологических процессов, включая тромбоз и кровотечение, заживление ран, воспаления, инсульты, инфаркты и многие другие [1, 2].

Нативная форма плазминогена (Glu-плазминоген) человека представляет собой полипептидную цепь, содержащую 791 аминокислотный остаток (Glu1-Asn791). Пространственная укладка цепи образует ряд глобулярных модулей: N-терминальный, так называемый PAN-apple домен (PAp), пять гомологичных крингл-доменов (КР1–КР5), структура каждого из которых стабилизирована тремя дисульфидными связями, сериновый протеазный домен (SP), содержащий каноническую для всех сериновых протеаз каталитическую триаду остатков His603, Asp646 и Ser741, а также гибкий линкер, соединяющий домены KР4 и KР5 между собой [3]. Крингл-домены содержат сайты связывания лизина, которые позволяют плазминогену связывать фибрин и другие субстраты, содержащие N-концевые лизины [4]. Glu-плазминоген находится в закрытой, устойчивой к активации конформации, в которой остатки лизина и аргинина (в частности, Lys50, Arg68 и Arg70), присутствующие на N-концевом домене PAp, связываются с лиганд-связывающими сайтами КР-4 и КР-5. Таким образом, закрытая конформация Glu- плазминогена частично опосредуется междоменными взаимодействиями через сайты связывания лизина [5].

Плазминоген может быть активирован в плазмин путем расщепления связи Arg561-Val562. N-концевая часть цепи (Glu1-Arg561) образует цепь А, которая ковалентно связана с цепью B (Ala562-Asn791) посредством дисульфидных связей Cys548-Cys666 и Cys558-Cys566.

В настоящее время общепризнано, что белки выступают в качестве основной мишени для активных форм кислорода (АФК) [6]. Эти производные кислорода способны повреждать белки, что оказывает влияние на их структуру, проявляющееся в более или менее выраженной потере ими свойственных им биохимических функций.

Ранее методом тандемной масс-спектрометрии [7] были идентифицированы сайты, модифицированные гипохлорит-индуцированным окислением молекулы плазминогена.

Перекись водорода (H₂O₂) является существенно менее агрессивным окислителем по сравнению с гипохлоритом. Она вырабатывается большинством клеток человеческого тела. Поступление в плазму H₂O₂, генерируемой во внутриклеточном пространстве клеток крови, незначительно по сравнению с генерацией H₂O₂ из источников в плазме крови или на внешней поверхности клеток [8]. Помимо НАДФН-оксидаз, плазматические мембраны фагоцитов, эндотелиальные клетки и тромбоциты вносят значительный вклад в генерацию плазменного H₂O₂ [9, 10]. Как полагают [8], значения концентрации H₂O₂ в плазме могут находиться в диапазоне от нескольких мкМ до сотен мкМ, в то время как некоторые авторы [11] сообщают, что концентрация H₂O₂ в плазме человека может быть существенно выше и достигать 100 мМ.

В данной работе впервые была предпринята попытка исследовать действие H₂O₂-индуцированного окисления плазминогена на модификацию отдельных сайтов в его первичной структуре, а также нарушение фибриногенолитической (гидролиз фибриногена) активности плазмина, образованного при активации окисленного плазминогена.

Glu-плазминоген был выделен из плазмы крови доноров методом аффинной хроматографии на лизин-активированной CNBr Sepharose 4B (Sigma-Aldrich), как описано ранее [12]. Фибриноген был получен из цитратной плазмы крови человека методом глицинового осаждения [7].

Превращение плазминогена в плазмин осуществляли стрептокиназой (Bechringwerke, Германия) в молярном соотношении 100/1 (плазминоген/стрептокиназа) [7]. Время инкубации смеси плазминогена и стрептокиназы составляло 40 мин при 37°С.

Фибриногенолитическая активность плазмина оценивалась по накоплению продуктов гидролиза фибриногена с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методике Laemmli.

Окисление плазминогена было индуцировано H₂O₂ (Sigma-Aldrich) в широком диапазоне концентраций окислителя, равным 50–400 мкМ при концентрации субстрата реакции 1 мкМ. После инкубации белка с окислителем (60 мин при 37°С) реакция была остановлена добавлением в каждый образец десятикратного молярного избытка L-метионина по отношению к окислителю. Для последующих работ (и избавления от метионина) образцы переводились в исходный буфер с использованием ультрацентрифужных фильтров Amicon Ultra, 10 КДа (Millipore, Ирландия).

Анализ, проведенный методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенный с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС), проводился на системе, включающей хроматограф Agilent 1100 c системой автоматического отбора проб (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) и тандемного масс-спектрометра 7T LTQ-FT Ultra (Thermo, Bremen, Germany) [13, 14]. При подготовке проб образцы обрабатывались дитиотреитолом (DTT) для восстановления дисульфидных связей c последующим алкилированием йодоацетоамидом и гидролизом трипсином (Promega, USA). Триптические пептиды были идентифицированы с помощью программного обеспечения PEAKS Studio (V. 8.5, Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, On, Canada). Для получения результатов было выполнено три независимых эксперимента, каждый из которых выполнялся в трех повторностях. При сравнении результатов учитывались аминокислоты, не окисленные в контроле, а также те, уровень окисления которых по сравнению с контролем, возрастал более чем на 1%.

Результаты электрофореза свидетельствуют о том, что при обработке белка окислителем во всем диапазоне концентраций плазминоген сохранял исходную гомогенность, т.е. не наблюдалось ни фрагментации белка, ни межцепочечного сшивания (рис. 1). Этот результат хорошо согласуется с полученными ранее электрофоретическими данными, которые также демонстрировали сохранение целостности полипептидной цепи плазминогена, обработанного гипохлоритом [7].

Рис. 1.

Эффект Н₂О₂ на молекулу плазминогена. Электрофореграмма свидетельствует об отсутствии каких-либо видимых нарушений в гомогенности полипептидной цепи белка. Полоса М соответствует молекулярным массам белковых маркеров.

Индуцированная стрептокиназой активация плазминогена, как видно из рис. 2, вызывала образование плазмина, о чем свидетельствуют два продукта активации, тяжелая (А) и легкая (В) полипептидные цепи, соответствующие молекулярным массам цепей плазмина, 70 и 25 кДа соответственно. Действие 50 и 300 мкМ Н₂О₂ на плазминоген не оказывало влияния на его расщепление стрептокиназой.

Рис. 2.

Влияние H₂О₂ на активацию стрептокиназой плазминогена. Как следует из результата электрофореза, активация стрептокиназой нативного плазминогена продуцировала два основных пептида (полоса К), соответствующих тяжелой А, (~70 кДа) и легкой В (~25 кДа) цепям плазмина. Активация стрептокиназой плазминогена, окисленного 50 (1) и 300 мкМ (2) Н₂О₂, не сопровождалась изменениями в электрофоретической подвижности А и В полипептидных цепей плазмина. Полоса М – молекулярные массы белковых маркеров.

Согласно данным ПААГ-электрофореза, обработка плазминогена 50 и 100 мкМ Н₂О₂ практически не влияла на гидролиз фибриногена, так как спектр продуктов деградации и их количество не отличались от свойственных контрольному образцу (рис. 3). Однако обработка исходного плазминогена 300 и 400 мкМ окислителя приводила к уменьшению накопленного фрагмента D и сохранению остаточного фибриногена в смеси (рис. 3).

Рис. 3.

Фибриногенолитическая активность плазмина, образованного из окисленного плазминогена, обработанного разными количествами Н₂О₂. Как видно из электрофореграммы, активность плазмина снижается, что проявляется в уменьшении содержания конечного продукта деградации фибриногена, фрагмента D, и сохранении остаточного фибриногена. Полоса М – молекулярные массы белковых маркеров.

Методом масс-спектрометрии высокого разрешения были проанализированы образцы плазминогена, подвергавшиеся воздействию 50 и 300 мкМ Н₂О₂. Модифицированные аминокислотные остатки и типы их модификации, обусловленные Н₂О₂-индуцированным повреждением белка, показаны в табл. 1.

Повышение дозы окислителя с 50 до 300 мкМ Н₂О₂ способствовало увеличению степени окисления большинства идентифицированных остатков таких, как Met57, локализованный в PAp домене; в домене КР4 – Met385, Met404, Trp417 и Trp427; в КР5 – Met463 и в каталитическом домене – Met585, Met788. В то же время степень окисления Trp108, Trp235 и Trp417, расположенных в доменах КР1, КР2 и КР4, соответственно, практически не изменялась и, кроме того, наблюдалось вовлечение в окислительную модификацию дополнительных двух остатков, Met182 и Trp382, локализованных в структуре КР2 и КР4, соответственно, степень окисления которых при действии 50 мкМ Н₂О₂ (рис. 4) не отличалась от таковой в контрольном образце. Этот эффект, вероятно, связан с конформационными превращениями в молекуле плазминогена при действии 300 мкМ Н₂О₂, делающих эти два остатка более пространственно доступными для окислителя.

Рис. 4.

3D-структура (PDB ID: 4DUU) плазминогена с обозначенными модификациями аминокислотных остатков (черные шары) при окислении белка 300 мкМ перекиси водорода.

Сравнение окислительных сайтов, возникающих в плазминогене при его обработке Н₂О₂ или гипохлоритом [7], обнаруживает ряд общих модифицированных остатков метионина, Met57, Met182, Met385, Met404, Met585 и Met 788 и один остаток триптофана, Trp235, в то время как некоторые остатки, Met463, Trp108, Trp382, Trp417 и Trp427, подвергаются модификации только под влиянием Н₂О₂. Что касается метионинов, по всей видимости, Met57, Met404 и Met585 можно рассматривать в качестве антиоксидантных остатков, поскольку они являются общими и наиболее легко окисляемыми для обоих окислителей. Известно, что антиоксидантные метионины локализованы на поверхности белковой глобулы и являются высоко уязвимой мишенью для различных активных форм кислорода (АФК) [15]. Интересно также отметить, что, как указывалось выше, степень окисления некоторых остатков, как, например, Trp108, Trp235 и Trp417 не меняется или меняется крайне незначительно при увеличении концентрации окислителя в 6 раз. Этот феномен может быть обусловлен также антиоксидантной ролью метионинов, которые перехватывают значительную часть окислителя при его увеличивающемся количестве, сохраняя таким образом умеренным окисление других остатков, некоторые из которых могут быть функционально значимыми. Кроме того, нельзя исключить возможность сохранения антиоксидантными метионинами целостности и других, важных в функциональном отношении остатков плазминогена. Идентификация этих остатков представляет огромную важность для понимания функционирования плазминогена в среде, генерирующей АФК, и является предметом будущих исследований.