1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 501, № 1, 2021

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 501, № 1, стр. 538-542

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АКТИВИРОВАННЫХ CD4+ Т-КЛЕТОК ПАМЯТИ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ НЕОТВЕТЧИКОВ НА ВЫСОКОАКТИВНУЮ АНТИРЕТРОВИРУСНУЮ ТЕРАПИЮ

В. В. Власова 1, *, Е. В. Сайдакова 1, Л. Б. Королевская 1, Н. Г. Шмагель 2, академик РАН В. А. Черешнев 1, 3, К. В. Шмагель 1

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук” – филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения Российской академии наук
Пермь, Россия

2 Государственное казенное учреждение здравоохранения Пермского края “Пермский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями”
Пермь, Россия

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук
Екатеринбург, Россия

* E-mail: violetbaudelaire73@gmail.com

Поступила в редакцию 09.07.2021
После доработки 31.08.2021
Принята к публикации 31.08.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Термином иммунологические неответчики (ИН) обозначают группу ВИЧ-инфицированных пациентов, у которых снижение вирусной нагрузки под действием высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) не приводит к эффективной регенерации пула CD4+ Т-клеток. Известно, что слабое восстановление численности CD4+ Т-лимфоцитов в организме ИН обусловлено непродуктивным делением клеток памяти. Исходя из того, что способность лимфоцитов к пролиферации во многом определяется активностью метаболических процессов, целью настоящей работы была оценка показателей митохондриального дыхания и гликолиза в CD4+ Т-клетках памяти у ИН. Обследованы две группы ВИЧ-инфицированных больных, получающих ВААРТ: иммунологические неответчики и пациенты с эффективным восстановлением иммунитета (иммунологические ответчики – ИО). В контрольную группу (К) вошли здоровые добровольцы. Установлено, что в двух группах ВИЧ-позитивных пациентов интенсивность гликолиза в CD4+ Т-лимфоцитах памяти снижена по сравнению с таковой в группе К. Активность митохондриального дыхания в CD4+ Т-клетках памяти ИО на базальном уровне была сопоставима с показателями К, но после стимуляции не достигала значений неинфицированных доноров. В группе ИН интенсивность митохондриального дыхания в CD4+ Т-лимфоцитах памяти была наименьшей и статистически значимо отличалась от значений ИО и К как на базальном уровне, так и после стимуляции. Полученные данные демонстрируют, что у ИН низкая регенераторная способность активированных CD4+ Т-лимфоцитов памяти может быть связана с метаболическими нарушениями в данных клетках.

Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, высокоактивная антиретровирусная терапия, CD4+ Т-лимфоциты, метаболизм, гликолиз, митохондрии

Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) вызывает выраженное снижение вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных больных [1], что, как правило, сопровождается увеличением численности CD4+ Т-лимфоцитов [2]. Однако у 10–30% пациентов подавление репликации ВИЧ не приводит к эффективной регенерации пула CD4+ Т-клеток [3]. Такие субъекты – “иммунологические неответчики” (ИН) – имеют высокий риск развития как ассоциированных, так и не ассоциированных со СПИД заболеваний, и повышенный уровень смертности [4].

Слабый прирост численности CD4+ Т-лимфоцитов у ИН, в значительной мере, обусловлен низкой продуктивностью пролиферации клеток памяти [5], которые являются основным источником регенерации CD4+ Т-лимфоцитов при лимфопении [6]. Известно, что способность клеток к делению в значительной степени зависит от активности их метаболических процессов, особенно гликолиза и митохондриального дыхания [7]. Так, аэробный гликолиз служит основным источником субстратов, участвующих в биосинтезе липидов, аминокислот и нуклеотидов – строительных блоков для дочерних лимфоцитов [8]. В свою очередь, митохондрии обеспечивают пролиферирующие клетки энергией, промежуточными продуктами синтеза белков и жирных кислот, а также сигнальными молекулами [9, 10]. Известно, что нарушение гликолиза или митохондриального дыхания в CD4+ Т-лимфоцитах приводит к остановке деления [11]. Ранее было показано, что в CD4+ Т-клетках ВИЧ-инфицированных пациентов, принимающих ВААРТ, снижена интенсивность окислительного фосфорилирования [12]. При этом активность метаболических процессов в CD4+ Т-клетках памяти у больных с неэффективным восстановлением иммунитета никем ранее не изучалась. Целью данной работы была оценка показателей митохондриального дыхания и гликолиза в CD4+ Т-клетках памяти ВИЧ-инфицированных иммунологических неответчиков на высокоактивную антиретровирусную терапию.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинические группы. План работы был одобрен этическим комитетом Пермского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (рег. № комитета IRB00008964). В исследование были включены ВИЧ-инфицированные пациенты, получающие ВААРТ более двух лет (вирусная нагрузка <50 копий/мл): 1) иммунологические неответчики (ИН; CD4+ Т-лимфоциты менее 350/мкл; n = 4); 2) иммунологические ответчики (ИО; CD4+ Т-клетки более 350/мкл; n = 4). В контрольную группу (К) вошли 4 неинфицированных ВИЧ добровольца.

Получение биоматериала. Забор крови осуществлялся натощак из локтевой вены в пробирки типа “Vacutainer”, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту. Численность CD4+ Т-лимфоцитов крови оценивали с использованием коммерческого набора BD Simultest™ IMK-Lymphocyte (“BD Biosciences”, США) на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (“Beckman Coulter”, США). Уровень вирусной нагрузки ВИЧ устанавливали наборами “Versant HIV-1 RNA 3.0 assay b” на анализаторе Versant 440 (“Siemens”, Германия).

Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности Диаколла (1.077 г/мл, “Диаэм”, Россия). Образцы помещали в жидкий азот в среде, содержащей 90% эмбриональной телячьей сыворотки (“Biowest”, Франция) и 10% диметилсульфоксида (“AppliChem”, Германия). После разморозки клеток CD4+ Т-лимфоциты памяти выделяли методом магнитной сепарации с использованием коммерческого набора Memory CD4+ T Cell Isolation Kit (“Miltenyi Biotec”, Германия) согласно инструкции производителя.

Анализ метаболических процессов. Изолированные CD4+ Т-клетки памяти ресуспендировали в среде XF RPMI Medium (“Agilent Technologies”, США), содержащей 10 мМ глюкозы (“Sigma”, США), 2 мМ глутамина (“Диа-М”, Россия) и 1 мМ пирувата натрия (“Sigma”, США) и вносили по 3 × 105 клеток в лунки планшета (“Agilent Technologies”, США), предварительно обработанные поли-D-лизином (50 мкг/мл, “Sigma”, США). Планшет центрифугировали в течение 2 мин при 200 g для формирования монослоя клеток. Объем лунки доводили до 150 мкл средой, планшет инкубировали при +37°С в течение 60 мин. Активность митохондриального дыхания и гликолиза определяли с использованием анализатора Seahorse XFe96 (“Agilent Technologies”, США) по показателям скорости потребления кислорода (oxygen consumption rate (англ.) – OCR) и скорости ацидификации среды (extracellular acidification rate (англ.) – ECAR) соответственно. Измерения производили на базальном уровне и после 40 мин стимуляции фитогемагглютинином (ФГА, 15 мкг/мл, “Serva”, Германия). На финальном этапе к образцам вносили ротенон и антимицин А (0.5 мкМ; “Agilent Technologies”, США), ингибирующие комплексы I и III дыхательной цепи митохондрий, соответственно, что позволило исключить из анализа немитохондриальное потребление кислорода.

Статистический анализ данных. Данные представлены в виде медиан, интерквартильных размахов (25–75 перцентиль) и 10–90%-ных интервалов. Достоверность различий между группами устанавливали на основе U-критерия Манна–Уитни. Проведение статистических расчетов и построение графиков осуществляли с использованием программного обеспечения “Statistica 6”.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Все исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и полу (табл. 1). Группы ВИЧ-инфицированных пациентов не отличались по длительности инфекции, продолжительности приема ВААРТ и вирусной нагрузке. Количество CD4+ Т-клеток в крови ИН было существенно снижено в сравнении с аналогичными показателями ИО и К (p < 0.01).

Таблица 1.

Клинические характеристики ВИЧ-инфицированных и здоровых лиц

Характеристики ИН, n = 4 ИО, n = 4 К, n = 4
Возраст (годы) 38.5* (33.3–44.5) 43.0 (37.0–52.0) 44.5 (28.0–58.8)
Женщины (%) 50 50 75
Длительность инфекции (годы) 5 (3–13) 6 (4–13) –
Продолжительность ВААРТ (годы) 3.2 (2.3–12.9) 5.2 (3.1–6.2) –
Вирусная нагрузка ВИЧ в крови (копии/мл) <50** <50 –
Численность CD4+ Т-клеток на момент исследования (мкл–1) 224 (193–272) pИН–ИО < 0.01
pИН–К < 0.01 		814 (522–870) 847 (607–1112)

Примечание: * – указаны медианы и интерквартильные размахи. ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики; К – контроль; ВААРТ – высокоактивная антиретровирусная терапия. ** – предел чувствительности тест-системы. Статистические расчеты выполнены по методу Манна–Уитни.

Рис. 1.

Базальная скорость потребления кислорода CD4+ Т-клетками памяти ВИЧ-инфицированных иммунологических неответчиков на высокоактивную антиретровирусную терапию.

По оси абсцисс: группы больных; по оси ординат: (а) скорость потребления кислорода (oxygen consumption rate – OCR) нестимулированными CD4+CD45RO+ Т-клетками; (б) скорость потребления кислорода CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитами, стимулированными фитогемагглютинином. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные размахи (прямоугольники) и 10–90%-ные интервалы (вертикальные отрезки). ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики, К – контроль. * – p < 0.05, ** – p < 0.01, *** – p < 0.001 (U-тест Манна–Уитни).

Базальная скорость потребления кислорода CD4+ Т-клетками памяти, полученными от ИН, была меньше, чем у ИО (p < 0.05) и К (p < 0.001; рис. 1a).Кратковременная активация клеток ФГА приводила к увеличению показателя митохондриального дыхания во всех исследуемых группах (p < 0.01). Однако активированные CD4+ Т-клетки памяти ВИЧ-инфицированных пациентов демонстрировали сниженный, в сравнении со здоровыми людьми, показатель OCR (pИН–К < 0.001; pИО–К < 0.01; рис. 1б). Важно отметить, что наиболее низкая скорость потребления кислорода стимулированными CD4+ Т-лимфоцитами памяти была отмечена у ИН (pИН–ИО < 0.05).

Показатель, отражающий скорость ацидификации среды CD4+ Т-клетками памяти, у ИН был ниже, чем у К (p < 0.001), однако превышал соответствующее значение, установленное у ИО (p < 0.05; рис. 2а).

Рис. 2.

Скорость ацидификации среды CD4+ Т-клетками памяти ВИЧ-инфицированных иммунологических неответчиков на высокоактивную антиретровирусную терапию.

По оси абсцисс: группы больных; по оси ординат: (а) скорость ацидификации среды (extracellular acidification rate – ECAR) нестимулированными CD4+CD45RO+ Т-клетками; (б) скорость ацидификации среды CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитами, стимулированными фитогемагглютинином. Представлены медианы (квадраты) и интерквартильные размахи (вертикальные отрезки). ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики, К – контроль. * – p < 0.05, *** – p < 0.001 (U-тест Манна–Уитни).

Внесение ФГА вызывало увеличение интенсивности гликолиза в клетках, что сопровождалось ростом значений ECAR во всех исследуемых группах (p < 0.01). При этом в обеих группах ВИЧ-инфицированных пациентов интенсивность этого процесса так и не достигла уровня, характерного для лимфоцитов здоровых субъектов (p < 0.001; рис. 2б). Между показателями ИН и ИО статистически значимых отличий обнаружено не было (p > 0.05).

Таким образом, в настоящей работе нами впервые показано, что у ВИЧ-инфицированных пациентов, принимающих ВААРТ, снижена активность аэробного гликолиза в CD4+ Т-клетках памяти. Более того, впервые отмечено, что у иммунологических неответчиков на лечение по сравнению со здоровыми добровольцами и ВИЧ-позитивными пациентами, давшими стандартный ответ на терапию, уменьшение гликолитической активности в CD4+ Т-лимфоцитах памяти сопровождается существенным снижением уровня митохондриального дыхания. Несмотря на то что под действием стимуляции интенсивность окислительного фосфорилирования в CD4+ Т-клетках памяти иммунологических неответчиков увеличивается, показатели этих пациентов не достигают значений, зафиксированных у ИО и здоровых субъектов. В совокупности полученные данные указывают на выраженное нарушение дыхательной функции митохондрий в CD4+ Т-лимфоцитах памяти ВИЧ-инфицированных пациентов с неэффективным восстановлением иммунной системы в ответ на ВААРТ. Следует отметить, что представленные результаты функциональных тестов подтверждают данные, полученные нами ранее при исследовании CD4+ Т-клеток памяти ex vivo [5]. В частности, было установлено, что у иммунологических неответчиков на ВААРТ по сравнению с лицами, давшими стандартный ответ на лечение, в активированных/циклирующих CD4+ Т-лимфоцитах памяти подавлена экспрессия генов, вовлеченных в энергетический обмен, в том числе кодирующих комплексы дыхательной цепи и ферменты цикла трикарбоновых кислот. Более того, активированные/циклирующие CD4+ Т-клетки памяти ИН имели сниженный трансмембранный потенциал митохондрий, что не зависело от массы органелл.

Как было отмечено ранее, способность Т-клеток к делению напрямую зависит от активности митохондриального дыхания. Действительно, недавнее исследование показало, что внесение ингибитора комплекса II электрон-транспортной цепи в культуру Т-лимфоцитов приводит к снижению мембранного потенциала митохондрий и пролиферативной активности данных клеток [13]. Аналогичный эффект на пролиферацию CD4+ Т-клеток оказывает ротенон – ингибитор комплекса I [11]. Кроме того, было показано, что в CD4+ Т-лимфоцитах нокаут гена IRF4, участвующего в регуляции метаболизма глюкозы и окислительного фосфорилирования, вызывает снижение активности дыхательной цепи и предотвращает деление [14]. Ранее нами также было установлено, что активированные/циклирующие CD4+ Т-клетки памяти ВИЧ-инфицированных пациентов с неэффективным восстановлением иммунитета не способны к продуктивной пролиферации in vitro и обладают низкой жизнеспособностью [5]. Представленные данные впервые позволяют заключить, что у иммунологических неответчиков на ВААРТ низкая регенераторная способность CD4+ Т-лимфоцитов памяти может быть связана с нарушением процессов гликолиза и митохондриального дыхания.

Список литературы

  1. Collier A.C., Coombs R.W., Schoenfeld D.A., et al. Treatment of human immunodeficiency virus infection with saquinavir, zidovudine, and zalcitabine. AIDS Clinical Trials Group // N Engl J Med. 1996. V. 334. № 16. P. 1011–1017.

  2. Autran B., Carcelain G., Li T.S., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease // Science. 1997. V. 277. № 5322. P. 112–116.

  3. Kelley C.F., Kitchen C.M., Hunt P.W., et al. Incomplete peripheral CD4+ cell count restoration in HIV-infected patients receiving long-term antiretroviral treatment // Clin Infect Dis. 2009. V. 48. № 6. P. 787–794.

  4. Piketty C., Weiss L., Thomas F., et al. Long-term clinical outcome of human immunodeficiency virus-infected patients with discordant immunologic and virologic responses to a protease inhibitor-containing regimen // Journal of Infectious Diseases. 2001. V. 183. № 9. P. 1328–1335.

  5. Younes S.A., Talla A., Ribeiro S.P. et al. Cycling CD4+ T cells in HIV-infected immune nonresponders have mitochondrial dysfunction // J Clin Invest. 2018. V. 128. № 11. P. 5083–5094.

  6. Koehne G., Zeller W., Stockschlaeder M., et al. Phenotype of lymphocyte subsets after autologous peripheral blood stem cell transplantation // Bone Marrow Transplant. 1997. V. 19. № 2. P. 149–156.

  7. Wahl D.R., Byersdorfer C.A., Ferrara J.L., et al. Distinct metabolic programs in activated T cells: opportunities for selective immunomodulation // Immunol Rev. 2012. V. 249. № 1. P. 104–115.

  8. Donnelly R.P., Finlay D.K. Glucose, glycolysis and lymphocyte responses // Mol Immunol. 2015. V. 68. № 2. P. 513–519.

  9. Diebold L., Chandel N.S. Mitochondrial ROS regulation of proliferating cells // Free Radic Biol Med. 2016. V. 100. P. 86–93.

  10. Ahn C.S., Metallo C.M. Mitochondria as biosynthetic factories for cancer proliferation // Cancer Metab. 2015. V. 3. № 1. P. 1.

  11. Cao Y., Rathmell J.C., Macintyre A.N. Metabolic reprogramming towards aerobic glycolysis correlates with greater proliferative ability and resistance to metabolic inhibition in CD8 versus CD4 T cells // PLoS One. 2014. V. 9. № 8. P. e104104.

  12. Korencak M., Byrne M., Richter E., et al. Effect of HIV infection and antiretroviral therapy on immune cellular functions // JCI Insight. 2019. V. 4. № 12. P. 126675.

  13. Nastasi C., Willerlev-Olsen A., Dalhoff K., et al. Inhibition of succinate dehydrogenase activity impairs human T cell activation and function // Sci Rep. 2021. V. 11. № 1. P. 1458.

  14. Mahnke J., Schumacher V., Ahrens S., et al. Interferon Regulatory Factor 4 controls TH1 cell effector function and metabolism // Sci Rep. 2016. V. 6. P. 35521.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал