Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 501, № 1, стр. 573-579

ВВЕДЕНИЕ

Препараты на основе графена являются одним из самых перспективных материалов в биомедицине. В биологических и медицинских исследованиях преимущественно применяются окисленные формы графена, а именно оксид графена (ОГ) [1, 2]. Очевидно, что постоянно растущий спектр применения препаратов на основе графена в in vivo терапии и диагностике диктует необходимость всесторонней оценки его биосовместимости. Известно, что взаимодействие препаратов на основе графена с клетками живых организмов зачастую приводит к нарушению/изменению их активности либо гибели [3, 4]. На настоящий момент известно, что графен и его производные, в том числе ОГ, индуцируют апоптоз, некроз, или аутофагию клеток [5]. В то же время покрытие наночастиц биосовместимыми полимерами, из которых самым актуальным является полиэтиленгликоль (ПЭГ), существенно снижает цитотоксичность ОГ [6].

Очевидно, что клетки иммунной системы являются первой линией контакта с наноматериалами, индуцируя возникновение возможных побочных реакций. Учитывая тот факт, что применение препаратов на основе оксида графена предполагает модулирование функциональной активности клеток иммунной системы, в частности, при их использовании в качестве адъювантов, антибактериальных и противоопухолевых препаратов, необходимо полноценно исследовать взаимодействие ОГ с клетками иммунной системы. В данный момент информация о взаимодействии оксида графена с клетками иммунной системы разнородна и носит не системный характер [7, 8].

Таким образом, целью исследования являлось изучение взаимодействия наночастиц ОГ с клетками линии Jurkat в системе прижизненного наблюдения Cell-IQ. Итогом наблюдений стала оценка жизнеспособности клеток и прироста клеточной массы Т-клеток линии Jurkat в присутствии наночастиц ОГ разного размера, покрытых линейным или разветвленным ПЭГ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили в соответствии с Хельсинкской Декларацией ВМА 2000 г. и протоколом Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г., на работу было получено разрешение этического комитета “ИЭГМ УрО РАН” (IRB00010009) от 30.08.2019.

В работе использовались наночастицы ОГ размерами 100–200 нм (ОГ-S) и 1–5 мкм (ОГ-L) (“Ossila Ltd”, Великобритания), которые покрывались линейным (ПЭГ) и разветвленным (ПЭГ8) полиэтиленгликолем. Для процедур функционализации использовалась монохлоруксусная кислота (99%), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC, 98%), N-гидроксисукцинимид (NHS, >98%), 8-arm-полиэтиленгликоль-(трипентаэритритное ядро)-NH₂ (ПЭГ8-NH₂, Mw 10 000 г/моль), метоксиполиэтиленгликоль амин mПЭГ-NH₂ (MW 5000 г/моль), производства “Alfa Aesar”, США. Все реактивы использовались без дополнительной очистки.

Модификация наночастиц ОГ линейным ПЭГ и разветвленным ПЭГ8 осуществлялась методом ковалентной пришивки аминогрупп к поверхностным карбоксильным группами ОГ с образованием амидной связи. Для этого растворы ОГ-L и ОГ-S (2 мг/мл) подвергались ультразвуковой обработке в течение 30 мин мощностью 25 и 150 Вт соответственно. Карбоксилирование ОГ проводилось в щелочной среде (NaOH) в присутствии Cl–CH₂–COOH при ультразвуковой обработке  в течение 1 ч. Полученный раствор ОГ-СООН нейтрализован многократной промывкой деионизованной водой. Далее к суспензии ОГ-СООН (рН 5, 6) при ультразвуковой обработке в течение 5 мин добавляли NHS (10 ммоль/л), EDC (4 ммоль/л) и ПЭГ-NH₂ (или 8ПЭГ-NH₂) (2 мг/мл), для окончания реакции ковалентной пришивки PEG раствор оставляли при комнатной температуре на  сутки. Полученные суспензии ОГ-ПЭГ или ОГ-8ПЭГ очищались методом диализа и трехкратной промывкой с центрифугированием этиловым спиртом с финальной сушкой при 65°С под вакуумом [9].

Изменение состава и структуры ОГ при его модификации полиэтиленгликолями характеризовали методами ИК-Фурье и УФ-вид спектроскопиями. ИК-Фурье спектры исходных и модифицированных ОГ были получены на спектрометре IFS 66/S Bruker в области 400–4000 см^–1. Образцы для анализа готовили прессованием таблеток с KBr (2 мг образца к 299 мг KBr). Спектры поглощения растворов исходного и модифицированных ОГ были определены на двухлучевом спектрофотометре UV 2600 в диапазоне длин волн 200–900 нм. Распределение исходного и модифицированных наночастиц ОГ по размеру, а также их дзета-потенциал в водных растворах определяли методом динамического светорассеяния на приборе ZetaPALS Brookhaven. Определение степени покрытия ОГ линейным ПЭГ и разветвленным ПЭГ8 проводили методом термогравиметрического анализа (ТГА). Термогравиметрический анализ исходных и модифицированных ОГ был проведен на совмещенном ТГ-ДСК приборе TGA/DSC 1 Mettler-Toledo при скорости нагревания 10 К/мин в диапазоне температур 30–900°С в инертной атмосфере аргона.

Для исследования in vitro использовали иммортализованную клеточную линию Jurkat 5332 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург) в конечной концентрации 1 млн жизнеспособных клеток на 1 мл питательной среды.

Клетки ресуспендировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI 1640, 10% бычьего сывороточного альбумина (“Sigma-Aldrich”) и 0.3 мг/мл L-глутамина (“Sigma-Aldrich”). Для каждого вида наночастиц ОГ делали три повторности культуры. Клетки с наночастицами культивировали в 24-луночном планшете (“Orange Scientific”, Бельгия, площадь лунки 1.86 см²), в течение 24 ч при температуре 37°С и 5% СО₂. Контролем служила культура клеток без наночастиц ОГ [10]. Прирост клеточной массы изучали с использованием возможностей интегрированной платформы для непрерывной фазово-контрастной визуализации живых клеток в реальном времени Cell-IQ^® v2 MLF (“CM Technologies”, Финляндия).

Для визуализации морфологических изменений и функциональной активности иммунокомпетентных клеток в каждой лунке выбирали три области съемки для фазово-контрастной микроскопии. В результате проведенного исследования было получено по 222 снимка для каждой лунки экспериментального планшета и по 74 снимка для каждой области визуализации. Для анализа прироста клеточной массы, по окончании съемки на основе полученных снимков формировались библиотеки изображений, на основе которых создавались протоколы, позволяющие с использованием специализированного программного обеспечения Cell-IQ Imagen™ (“CM Technologies”, Финляндия) проводить автоматизированный подсчет прироста клеточной массы в экспериментальных условиях. На основе полученных данных строились кривые, отражающие прирост клеточной массы.

По истечении 24 ч проводили окрашивание клеток йодидом пропидия (PI, “Thermo Fisher Scientific”, США) с последующим анализом на проточном цитофлуориметре MACS Quant Analyzer 10 (“Miltenyi Biotec”, Германия). Учитывая, что оксид графена обладает собственной автофлуоресценцией [11], для более четкой картины жизнеспособность оценивали на 2 каналах FL3 (585/40 нм) и FL4 (655–730 нм). Дополнительно оценивали количество клеток, интернализировавших или связавших наночастицы ОГ, по количеству высокогранулярных клеток в гейте живых Jurkat по показателю бокового светорассеяния (SSC). Обработка данных осуществлялась с использованием программы KALUZA Analysis Software (“Beckman Coulter”, США), результаты выражали в виде процента живых клеток в гейте целевой популяции и в виде процента высокогранулярных клеток (табл. 2).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью стандартных пакетов STATISTICA for Windows 10.0. Рассчитывали параметры распределений: медиану (Ме), 25%-ный (Q1) и 75%-ный (Q3) квартили, достоверность различий оценивали с использованием критерия Манна–Уитни. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования полученных нами пегилированных образцов наночастиц ОГ показали, что процесс химической модификации прошел успешно вне зависимости от размеров графеновых частиц, ароматическая структура ОГ не изменилась, а средний размер наночастиц пегилированного ОГ по сравнению с исходным, заявленным производителем, снижается (табл. 1).

Клеточная линия Jurkat представляет собой иммортализованную клеточную линию Т-лимфоцитов, которые быстро пролиферируют и обладают характеристиками, сходными с Т-лимфоцитами человека. Т-клетки Jurkat используют для изучения иммунных и цитотоксических реакций на противоопухолевые препараты, токсиканты и биоматериалы [12].

В нашем исследовании изучалась динамика изменения клеточной массы Т-клеток Jurkat в условиях соинкубирования с наночастицами ОГ. Данные представлены в виде кривых динамики клеточной массы, где каждая кривая – это усредненное значение числа клеток по трем точкам визуализации. Показано, что в контрольных лунках наблюдалось почти двухкратное повышение числа клеток Jurkat в точках визуализации по прошествии 24 ч культивирования (рис. 1а).

Рис. 1.

Усредненные кривые динамики клеточной массы Jurkat при культивировании для трех повторностей в условиях взаимодействия с наночастицами ОГ (n = 3, по три точки визуализации). (а) Показано взаимодействие клеток Jurkat с наночастицами ОГ-ПЭГ-S; (б) Показано взаимодействие клеток Jurkat с наночастицами ОГ-ПЭГ-L.

Стоит отметить линейность прироста клеток Jurkat начиная с первого часа культивирования и высокий уровень сходимости результатов между лунками. При анализе фотокадров мы также видим существенное увеличение числа клеток в точке визуализации за 24 ч инкубации (рис. 2).

Рис. 2.

Фотографии, демонстрирующие события в одной точке визуализации при взаимодействии клеток линии Jurkat с наночастицами ОГ-ПЭГ в динамике наблюдения (1 ч, 24 ч).

По сравнению с контрольной группой наночастицы ОГ-ПЭГ-S (5, 25 мкг/мл) не показывали прироста количества клеток в точках визуализации при обоих концентрациях исследуемого образца (рис. 1а). При анализе фотокадров мы видим, что наночастицы ОГ-ПЭГ-S в высокой концентрации (25 мкг/мл) вызывали формирование клеточных агрегатов, которое не сопровождалось, тем не менее, снижением жизнеспособности клеток в сравнении с пробой, содержащей ОГ-ПЭГ-S в низкой концентрации (5 мкг/мл) (рис. 2).

При культивировании клеток линии Jurkat с ОГ-ПЭГ8-S (5, 25 мкг/мл) количество клеток в точках визуализации практически не изменялось, уровень сходимости результатов в зависимости от повторности был высоким (рис. 1а). Таким образом, наночастицы малой размерности (ОГ-ПЭГ-S 184 ± 73 нм; ОГ-ПЭГ8-S 287 ± 52 нм) существенно (более чем в 2 раза) подавляли рост клеток в культурах по сравнению с контрольной группой, при этом тип пришитого к наночастицам ПЭГ не имел значения для реализации этих эффектов.

При культивировании клеток линии Jurkat с наночастицами большей размерности (ОГ-ПЭГ-L 569 ± 14 нм; ОГ-ПЭГ8-L 1376 ± 48 нм) было показано,  что под воздействием ОГ-ПЭГ-L (5, 25 мкг/мл) отмечено плавное снижение количества клеток в точках визуализации с высоким уровнем сходимости результатов в зависимости от повторности. Довольно интересно, что в первые 4 ч фиксировался незначительный прирост клеток, который затем переходил в постепенное снижение числа клеток. Наночастицы, покрытые разветвленным ПЭГ (ОГ-ПЭГ8-L), также подавляли рост клеток Jurkat на протяжении всего периода наблюдения (рис. 1б). Аналогично с образцами ОГ малой размерности, наночастицы большой размерности подавляли количество клеток в точках визуализации при обоих концентрациях исследуемого образца. При анализе фотокадров мы видим, что наночастицы ОГ-ПЭГ-L в концентрации 25 мкг/мл вызывали формирование клеточных агрегатов, как и в случае с частицами ОГ-ПЭГ-S (рис. 2). Очевидно, что именно концентрация, а не тип наночастиц вызывает формирование клеточных агрегатов.

Таким образом, установлено, что наночастицы ОГ способны подавлять пролиферацию клеток линии Jurkat, при этом размер, концентрация и тип пегилирования не имели принципиального значения. Проведенный статистический анализ показал, что различия начинали фиксироваться после 4 ч в зависимости от типа частиц, однако по истечении 24 сут все эффекты были достоверны.

При оценке жизнеспособности клеток Jurkat после суточного сокультивирования с наночастицами ОГ было показано, что число живых клеток снижалось на 5–9%, независимо от типа используемых частиц (табл. 2). Невзирая на то что статистический анализ не выявил достоверных отличий, что связано с малым числом повторов, мы не можем игнорировать видимое снижение жизнеспособности клеток в нашей экспериментальной системе. В то же время проанализировав количество высокогранулярных клеток в культуре (табл. 2), мы увидели, что в присутствии наночастиц ОГ количество этих клеток увеличивается в среднем на 2–4%, что свидетельствует о том, что некоторые клетки линии Jurkat связывают и/или интернализируют наночастицы ОГ.

В целом получены сопоставимые результаты по приросту клеточной массы и количеству живых клеток в культуре клеток Jurkat при взаимодействии с наночастицами ОГ. Полученные данные свидетельствуют о том, что наши наночастицы ОГ оказывают цитотоксический эффект на клетки линии Jurkat, снижая уровень живых клеток на 5–6%, одновременно подавляя пролиферацию этих клеток. В частности, наночастицы ОГ более чем в два раза снижали прирост клеточной массы, фиксируемый в системе прижизненной визуализации CELL-IQ, при этом сохраняя стабильное число клеток в течение всего периода наблюдения (24 ч). Мы предполагали, что высокая концентрация наночастиц (25 мкг/мл) должна была оказывать более выраженный эффект, однако наша гипотеза не подтвердилась.

Известно, что наночастицы ОГ способны дозозависимо подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов, при этом надо учесть тот факт, что исследователи применяли не модифицированные наночастицы ОГ размером ~1 мкм, в концентрации 1; 12; 25 мкг/мл [13]. Относительно недавно появились сведения о влиянии ОГ и аминированного ОГ (ОГ-NH₂), полученные при помощи одновременного анализа транскриптома клетки с “single-cell” масс-цитометрией. Было продемонстрировано, что ОГ снижал жизнеспособность активированных Т-хелперов в большей степени, чем ОГ-NH₂ [14].

Невзирая на то что в литературе отсутствуют сведения о непосредственном поглощении наночастиц ОГ клетками линии Jurkat, известно, что они способны пассивно интернализовать золотые наночастицы (25 и 50 нм) [15]. Мы продемонстрировали, что лишь малая часть клеток связывает или интернализует ОГ. Таким образом, цитотоксический эффект на клетки линии Jurkat обусловлен не поглощением, а присутствием частиц ОГ в культуральной среде.

Известно, что само присутствие частиц на основе графена способно подавлять пролиферацию клеток и вызывать их гибель [16]. Механизмы цитотоксического действия наночастиц ОГ описаны на разных типах клеток и включают в себя окислительный стресс, митохондриально-опосредованный апоптоз, аутофагию, лизис клеток и фрустрированный фагоцитоз [17]. Используемая в работе методология не позволяет достоверно оценить конкретный механизм цитотоксичности наночастиц ОГ, однако это станет целью нашей дальнейшей работы.