Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 503, № 1, стр. 161-165

Основным регулятором синтеза тиреоидных гормонов – тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3) в тироцитах, специализированных клетках щитовидной железы (ЩЖ), является тиреотропный гормон (ТТГ), секретируемый аденогипофизом в ответ на стимуляцию тиролиберином, гипоталамическим ТТГ-рилизинг-гормоном (ТРГ) [1]. ТТГ специфически связывается с локализованным на поверхности тироцитов G-белок-сопряженным рецептором ТТГ, активируя аденилатциклазный и фосфолипазный пути и усиливая экспрессию и активность белков, ответственных за синтез Т4 (тиреоглобулин, тиреопероксидаза, Na⁺/I^–котранспортер) и его конверсию в Т3 (D2-дейодиназа) [2]. В случае мутаций в эктодомене рецептора ТТГ, препятствующих его связыванию с гормоном, а также при воздействии на рецептор ТТГ инактивирующих аутоантител развивается резистентность ЩЖ к ТТГ, что ведет к субклиническому гипотиреозу [3, 4].

Одним из подходов для стимуляции рецептора ТТГ может стать применение аллостерических регуляторов с активностью полных агонистов [5, 6]. Их особенностью является способность стимулировать рецепторы гипофизарных гликопротеиновых гормонов, которые имеют инактивирующие мутации в эктодомене и потому не чувствительны к гормонам [5]. Ранее нами были разработаны пептидные аллостерические агонисты рецептора ТТГ, способные взаимодействовать с аллостерическим сайтом, сформированным цитоплазматическими петлями [7]. Однако, несмотря на активность в условиях in vitro, они имели ограничения в условиях in vivo, что было обусловлено их деградацией. Более перспективным является разработка более устойчивых гетероциклических соединений, способных проникать в аллостерический сайт, расположенный в трансмембранном домене рецептора ТТГ [5]. Нами на основе структуры тиено[2,3-d]-пиримидина было разработано соединение TP48 с активностью аллостерического антагониста рецептора ТТГ, которое может быть использовано для нормализации тиреоидного статуса при аутоиммунном гипертиреозе [8]. Целью настоящего исследования было создать лиганд аллостерического сайта рецептора ТТГ, который, как и TP48, имеет тиено[2,3-d]-пиримидиновую структуру, но в отличие от него активирует рецептор ТТГ. Была поставлена задача изучить его влияние на генную экспрессию тироидогенных белков и рецептора ТТГ в культуре тироцитов и в условиях in vivo исследовать его влияние на базовый и стимулированный ТРГ тиреоидогенез у крыс.

Для синтеза этил-2-(4-(4-(5-амино-6-(трет-бутилкарбамоил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]-пиримидин-4-ил)фенил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил) ацетата (TPY3m) использовали реакцию между 5-амино-N-(трет-бутил)-4-(4-этинилфенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамидом и этил-2-азидоуксусной кислотой в присутствии медь-содержащих катализаторов. После очистки с помощью ВЭЖХ полученный продукт (T_пл. 218.1–218.6°C) был охарактеризован с помощью ¹H-ЯМР (“Bruker Avance III 400”, Германия) и масс-спектрометрии (“Bruker micrOTOF”, Германия). Спектр ¹H-ЯМР (400 МГц, хлороформ-d): δ 8.09–8.03 (m, 3H Ar phenyl + Ar triazol), 7.76 (d, J = 7.9 Hz, 2H Ar phenyl), 5.32 (s, 2H CArCH₂C(O)), 5.26 (m, 3H NH₂ + NH), 4.34 (q, J = 7.1 Hz, 2H CH₂ C(O)OEt), 2.69 (s, 3H MeS), 1.48 (s, 9H tBu), 1.36 (t, J = 7.2 Hz, 3H CH₃ C(O)OEt). Масс-спектр (ESI+, 100 В, CH₃OH): найдено – 526.1695 [M+H]; рассчитано для C₂₄H₂₈N₇O₃S$_{2}^{ + }$ – 526.1690.

В экспериментах использовали 3–4-месячных крыс Wistar, которых содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к корму и воде. Клеточную линию тироцитов FRTL-5 получали из “European Collection of Authenticated Cell Cultures”. Культивирование проводили в среде F-12 с добавлением 6 гормонов и ростовых факторов (F–12+6Н): 1 мЕД/мл ТТГ (“Elabscience”, США) 10 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл ростового фактора печени, 10 нМ гидрокортизона (“Sigma”, США), 10 нг/мл соматостатина (“Tocris Bioscience”, Великобритания), 5 мкг/мл трансферрина (“Биолот”, Россия) [9]. Перед экспериментом клетки снимали с подложки, используя раствор трипсина-версена (1: 1), пересеивали в полную ростовую среду F–12+6Н (4.3 × 10⁴ клеток/0.25 мл среды/лунку), через 48 ч переводили в среду F–12+5Н без ТТГ. Через 24 ч клетки инкубировали с 30 мкМ TPY3m, 6 мЕД/мл ТТГ или TPY3m+ТТГ. Через 6 ч оценивали экспрессию целевых генов.

В экспериментах in vivo TPY3m вводили крысам (25 мг/кг, в/б, в 200 мкл ДМСО). ТРГ (“Sigma”, США) вводили интраназально в дозе 100 мкг/крысу, как описано ранее [10]. Контрольным крысам вместо TPY3m вводили ДМСО и вместо ТРГ физиологический раствор. ТРГ вводили через 30 мин после TPY3m. Формировали 4 группы (во всех n = 5) – контроль, группы с обработкой TPY3m, ТРГ и TPY3m+ТРГ. Образцы крови получали из хвостовой вены, используя анестезию 2%-ным раствором лидокаина, до введения и через 1.5 и 3 ч после введения ТРГ. Для определения уровней свободного (fТ4) и общего (tТ4) тироксина и свободного (fТ3) и общего (tТ3) трийодтиронина использовали наборы фирмы “Иммунотех” (Россия).

Экспрессию генов в клетках FRTL-5 и ткани ЩЖ оценивали с помощью ПЦР в реальном времени, для чего с помощью набора “Extract RNA” выделяли тотальную РНК, а обратную транскрипцию проводили с помощью набора “MMLV RT Kit” (“Евроген”, Россия). Смесь для амплификации содержала 10 нг ПЦР-продукта, по 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров, а также реагент qPCRmix-HS SYBR+LowROX (“Евроген”, Россия). Детекцию сигнала осуществляли с помощью амплификатора “7500 Real-Time PCR System” (“Thermo Fisher Scientific Inc.”, США). Данные рассчитывали методом delta-delta C_t, используя в качестве референсных генов 18S rRNA (18S-рРНК) и Actb (β-актин). Анализировали экспрессию тиреоглобулина (Tg), тиреопероксидазы (TPO), Na⁺/I^–котранспортера (Nis), D2-дейодиназы (Dio2) и рецептора ТТГ (TshR).

Статистический анализ данных осуществляли с помощью программы “Microsoft Office Excel 2007”, нормальность распределения проверяли с использованием критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения двух выборок с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента, для сравнения 4 групп – дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. Данные представляли как M ± SEM, значимыми считали различия при p < 0.05.

Добавление ТТГ и TPY3m в инкубационную среду после 24-часовой ТТГ-депривации приводило к повышению экспрессии гена Nis в клетках FRTL-5, причем эффект ТТГ был более выражен (рис. 1). ТТГ также повышал экспрессию гена Tg (рис. 1). При совместном воздействии отмечали усиление стимулирующего эффекта ТТГ на экспрессию гена Tg и сохранение эффекта гормона на экспрессию гена Nis (рис. 1). Тем самым TPY3m проявляет свойства агониста рецептора ТТГ и не препятствует эффектам ТТГ. Последнее обусловлено различной локализацией ортостерического сайта, с которым связывается ТТГ (эктодомен), и аллостерического сайта, с которым связываются низкомолекулярные регуляторы рецептора (трансмембранный домен) [11]. TPY3m слабо влиял на экспрессию TshR. ТТГ ее снижал, что является результатом компенсаторного ответа клеток на ТТГ-индуцированную гиперактивацию рецептора и ранее было показано Saji M. et al. [12]. При совместном воздействии отмечали частичное восстановление экспрессии гена рецептора ТТГ (рис. 1).

Рис. 1.

Эффекты ТТГ и TPY3m на экспрессию генов тиреоглобулина (Tg), Na⁺/I^–-котранспортера (Nis) и рецептора ТТГ (TshR) в культуре тироцитов FRTL-5, предварительно инкубированных в среде без ТТГ. К – контроль, ТТГ, TPY3m и TPY3m+ТТГ – клетки, инкубированные с ТТГ (6 мЕД/мл), TPY3m (30 мкМ) и совместно ТТГ и TPY3m. Различия с К (a), с ТТГ (b) и между TPY3m и TPY3m+ТТГ (с) статистически значимы при p < 0.05. M ± SEM, n = 5.

Внутрибрюшинное введение крысам TPY3m через 2 ч повышало уровень tT4, в то время как через 3.5 ч повышались уровни обоих форм Т4 (табл. 1). ТРГ был активнее и через 3 ч повышал уровни всех тиреоидных гормонов (табл. 1).

При совместном введении ТРГ и TPY3m стимуляция продукции тиреоидных гормонов повышалась. Через 3.5 ч повышение уровня обеих форм Т3 было большим, чем сумма приростов при введении ТРГ или TPY3m, что может указывать на потенцирующий эффект TPY3m на ТРГ-индуцированную стимуляцию продукции fT3 и tT3 (табл. 1). Содержание общего и свободного Т4 при совместном введении ТРГ или TPY3m было выше, чем при их раздельном введении, но потенцирующего эффекта в этом случае выявлено не было (табл. 1). Таким образом, по способности стимулировать продукцию тиреоидных гормонов у крыс TPY3m может быть отнесен к аллостерическим агонистам рецептора ТТГ.

Исследование генной экспрессии в ЩЖ показало, что ТРГ повышает экспрессию генов Tg, TPO и Dio2 и снижает экспрессию гена рецептора ТТГ (рис. 2). TPY3m повышал экспрессию генов TPO и Dio2. При этом экспрессия гена TshR в группе с обработкой TPY3m не только не снижалась, но даже повышалась, хотя различия с контролем не были значимыми (рис. 2). Необходимо отметить, что тиено[2,3-d]-пиримидины с активностью агонистов рецептора лютеинизирующего гормона, родственного рецептору ТТГ, также слабо влияют на экспрессию своего рецептора [13]. В условиях совместного воздействия стимулирующие эффекты ТРГ на экспрессию тиреоидогенных генов сохранялись, а в случае гена Nis эффект ТРГ усиливался (рис. 2). Наряду с этим исчезал ингибирующий эффект ТРГ на экспрессию гена TshR (рис. 2). Мы полагаем, что восстановление экспрессии TshR в группе TPY3m+ТРГ по сравнению с группой ТРГ обеспечивает нормализацию чувствительности тироцитов к агонистам рецептора ТТГ. Частичное восстановление экспрессии TshR в присутствии TPY3m было обнаружено нами и в культуре тироцитов (рис. 1). Тем самым потенцирующий эффект TPY3m на экспрессию Tg в культуре тироцитов FRTL-5 и на продукцию Т3 и экспрессию Nis в ЩЖ крыс группы TPY3m+ТРГ может быть, по крайней мере, частично, обусловлен нормализацией экспрессии рецептора ТТГ и сохранением активности ТТГ-зависимых каскадов в условиях их гиперактивации ТТГ. Однако нельзя исключить того, что TPY3m может быть наделен не только активностью агониста, но и функционировать как положительный аллостерический модулятор (PAM). Такую активность проявляет ряд лигандов аллостерического сайта G-белок-сопряженных рецепторов, обозначаемых как аго-PAM [14, 15].

Рис. 2.

Эффекты тиролиберина и TPY3m на экспрессию генов тиреоидогенных белков и рецептора ТТГ в щитовидной железе крыс. К – контроль; ТРГ, TPY3m и TPY3m+ТРГ – группы крыс, обработанные ТРГ (100 мкг/крысу, интраназально), TPY3m (25 мг/кг, в/б) и совместно ТРГ и TPY3m. Различия с контро-лем (a), группой ТРГ (b) и между группами TPY3m и TPY3m+ТРГ (c) статистически значимы при p < 0.05. M±SEM, n = 5.

Таким образом, на основе тиено[2,3-d]-пиримидиновой структуры нами разработан новый аллостерический агонист рецептора ТТГ – TPY3m, который стимулировал продукцию тироксина при его в/б введении крысам, а также стимулировал экспрессию тиреоидогенных генов в клеточной культуре тироцитов FRTL-5 и ЩЖ крыс. TPY3m не вызывал снижения экспрессии гена рецептора ТТГ, а при совместном введении с ТТГ (FRTL-5) или ТРГ (ЩЖ) ее восстанавливал. Это, как мы полагаем, обусловливает сохранение, а в ряде случаев потенцирование эффектов ТТГ (FRTL-5) или ТРГ (крысы) на тиреоидогенез. TPY3m может рассматриваться как прототип препарата для коррекции тиреоидогенной функции ЩЖ при субклиническом гипотиреозе, в том числе обусловленном резистентностью к ТТГ, а также для ускорения поглощения радиоактивного йода тироцитами при диагностике и радиотерапии рака ЩЖ.