Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 503, № 1, стр. 172-176

Злокачественные опухоли кроветворной и лимфоидной ткани составляют примерно 8% всех злокачественных заболеваний. Они делятся на две большие группы – лимфомы и лейкозы; многие из них характеризуются неблагоприятным прогнозом и низким уровнем выживаемости. Поиск маркеров и терапевтических мишеней для персонифицированного лечения онкологических заболеваний показал, что продукт гена POU2F1(Oct-1) является чрезвычайно значимым фактором развития и прогрессирования многих злокачественных опухолей как эпителиального происхождения, так и опухолей кроветворной и лимфоидной ткани [1].

Фактор транскрипции Oct-1 принадлежит к семейству POU-факторов транскрипции с высококонсервативным ДНК-связывающим доменом и контролирует дифференцировку, выживаемость и пролиферацию клеток иммунной системы и гемопоэтических клеток [2, 3]. Oct-1 экспрессируется во всех клетках организма, регулирует дифференцировку В- , Т-клеток и стволовых гемопоэтических клеток [2, 3] и является фактором защиты клетки от разных видов стресса: генотоксического, окислительного, гипоксического, стресса эндоплазматического ретикулума, а также модулирует ответ клетки на химиотерапевтические препараты [4, 5].

Повышение уровня экспрессии Oct-1 в опухолевых клетках вносит существенный вклад в неблагоприятный прогноз развития онкологических заболеваний. Так, например, определение уровня экспрессии POU2F1(Oct-1) при раке желудка имеет даже более высокое прогностическое значение, чем определение стадии (I-IV) заболевания по AJCC [6]. Для опухолей кроветворной системы проонкогенные функции Oct-1 были описаны для лимфомы Ходжкина, лимфомы тимуса, диффузной крупноклеточной В-лимфомы, острого миелоидного лейкоза [7–9]. Сверхэкспрессия Oct-1 часто наблюдается при диффузной B-крупноклеточной лимфоме и является независимым прогностическим фактором неблагоприятного исхода [8]. Oct-1 является важным регулятором лейкемогенности и гемопоэтического стресса. Высокий уровень экспрессии фактора транскрипции Oct-1 защищает гемопоэтические клетки от стресса, но способствует развитию лимфомы тимуса [1] и острого миелоидного лейкоза [9] у мышей. Напротив, подавление Oct-1 защищает мышей от лейкемии, вызванной гибридным онкопротеином MLL-AF9. Комбинация этой модельной системы ОМЛ с нокаутом Oct-1 показала, что потеря одного аллеля Oct-1 значительно задерживает развитие лейкоза. Делеция обоих аллелей Oct-1 полностью защищает мышей от лейкоза, но приводит к недостаточности костного мозга и гибели животных. [9]. Анализ этих данных указывает на то, что Oct-1 – мощный фактор, определяющий злокачественный потенциал опухоли и ее ответ на действие химиотерапевтических препаратов.

Полифункциональность Oct-1 в значительной степени определяется тем, что он существует в клетке в виде ряда различных изоформ, которые образуются за счет альтернативного сплайсинга и/или альтернативной инициации транскрипции [10]. В гене POU2F1 существуют альтернативные промоторы [10–12]. Как видно из рис. 1, считываемые с них транскрипты имеют разные первые экзоны и кодируют изоформы, различающиеся своими N-концевыми последовательностями [11]: убиквитарная изоформа Oct-1A считывается с промотора U, а тканеспецифические изоформы Oct-1L и Oct-1R – с промотора L.

Рис. 1.

Экзон-интронная организация гена POU2F1(Oct-1). Схема строения изоформ, транскрибирующихся с убиквитарного промотора U и тканеспецифического промотора L. Экзоны обозначены прямоугольниками. Альтернативные 5'-концевые экзоны обозначены штриховкой. Начало транскрипции показано на схеме гена поворотными стрелками. Начало трансляции и стоп-кодоны обозначены стрелками и звездочками соответственно.

Экспрессия изоформ Oct-1 изменяется во время дифференцировки гематопоэтических клеток: в плюрипотентных гематопоэтических клетках CD34+ (ПГК) Oct-1L экспрессируется на высоком уровне; во время дифференцировки Т-клеток (CD3+) и клеток моноцитарного ряда (CD14+) его уровень экспрессии резко падает, но при этом почти не изменяется при дифференцировке B-клеток (CD19 +) [13, 14]. Изоформа Oct-1R у человека экспрессируется только в В-клетках, в ПГК она не обнаружена [13]. Характерно, что уровень убиквитарной изоформы Oct-1A не претерпевает значительных изменений при дифференцировке гематопоэтических клеток.

Во всех нормальных кроветворных клетках активность тканеспецифического промотора L, а следовательно, и концентрация тканеспецифических изоформ, ниже, чем активность убиквитарного промотора U и концентрация убиквитарной изоформы Oct-1А. При этом в В-клеточных лимфомах Беркитта Namalwa и Raji данное соотношение нарушено, и концентрация изоформы L значительно превосходит содержание в клетках изоформы А. Концентрация тканеспецифичной изоформы Oct-1L в В-клетках Namalwa в несколько раз выше, чем в нормальных В-клетках (CD19+) [13]; уровень ее экспрессии также повышен в Т-клеточной линии Jurkat по сравнению с нормальными Т-клетками (CD3 +) [13]. Примечательно, что все эти клеточные линии изначально были получены из низкодифференцированных лимфобластов.

Ранее было показано, что сверхэкспрессия Oct-1R и Oct-1L в клетках Namalwa приводит к репрессии многих генов, участвующих в дифференцировке В- и Т-лимфоцитов, а также клеток моноцитарного ряда (CD14+) [13, 14]. Высокий уровень изоформы Oct-1L, наблюдаемый в лимфобластных линиях опухолевых клеток, показывает, что избыток Oct-1L, по всей видимости, значительно уменьшает их способность к дифференцировке. Существование альтернативных промоторов в гене POU2F1(Oct-1) позволяет влиять не только на экспрессию тотального Oct-1, что губительно сказывается на организме, но также на экспрессию отдельных его изоформ, уровень которых повышен в опухолевых клетках.

В данной работе мы исследовали влияние 5-азацитидина на транскрипцию гена POU2F1 и показали, что он избирательно подавляет транскрипцию с тканеспецифического L-промотора гена POU2F1 и уменьшает концентрацию изоформы Oct-L в опухолевых клетках лимфомы Беркитта Namalwa.

Ингибитор метилирования ДНК 5-азацитидин применяется в клинической практике для лечения миелодиспластического синдрома (МДС) и острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). Для изучения его влияния на уровень транскрипции альтернативных изоформ белка Ост-1 клетки Namalwa рассевали в 6-луночные планшеты по 2 × 10⁶ на лунку в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки. К клеткам добавляли 5-азацитидин (5-Azacytidine, Sigma-Aldrich), растворенный в 8 мкл ДМСО, в следующих концентрациях: 10, 5, 2.5, 1.25 μМ. В контрольные лунки добавляли по 8 мкл ДМСО. Для оценки воздействия 5-азацитидина на уровень транскрипции разных изоформ Oct-1 из клеточной культуры выделяли РНК тризольным методом, после чего проводили обратную транскрипцию с использованием набора Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (Thermo Scientific) и ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, специфичных к изоформам А и L (Oct-1A-sense: 5'-tattcaaaatggcggacgga-3'; Oct-1L-sense: 5'-ccaccccaaactgctacctgt-3'; Oct-1-antisense, общий для обеих изоформ: 5'-ctgacggattgttcattcttgagt-3'). Нормировку проводили по гену GUS: GUS sense: 5'-cgtggttggagagctcatttgga-3' и GUS antisense 5'-attccccagcactctcgtcggt-3'.

Как видно из рис. 2, при культивировании клеток Namalwa в течение 24 ч в среде, содержащей 5-азацитидин, значительно снижается количество изоформы Oct-1L, транскрибирующейся с альтернативного тканеспецифического промотора L, тогда как количество мРНК убиквитарной изоформы Oct-1A практически не изменяется. Этот эффект дозозависимый и проявляется на уровне концентраций, применяемых в клинической практике. При концентрации 5-азацитидина 10 μМ в культуральной среде количество мРНК Oct-1L в клетках Namalwa снижалось в три раза по сравнению с контролем, а при концентрации 5 μМ – в два раза. Дальнейшее понижение концентрации 5-азацитидина не вызывало достоверных изменений в экспрессии Oct-1L.

Рис. 2.

Влияние 5-азацитидина на транскрипцию с альтернативных промоторов U и L гена POU2F1(Oct-1). Результаты количественной ПЦР. На диаграмме представлено среднее значение ±S.E.M. для трех независимых экспериментов; t-тесты были выполнены, чтобы определить, существует ли значимая разница между средними значениями для контрольных и обработанных клеток (**p < 0.01).

Из представленных результатов видно, что 5-азацитидин подавляет транскрипцию с тканеспецифического промотора L, снижая концентрацию тканеспецифических изоформ в опухолевых клетках, но практически не влияет на транскрипцию с убиквитарного промотора U и концентрацию мРНК убиквитарной изоформы А.

В низких концентрациях, которые применяются в настоящее время в онкогематологической практике, 5-азацитидин является гипометилирующим агентом, который ингибирует ДНК-метилтрансферазу путем включения в ДНК азацитидинтрифосфата. Это приводит к потере метилирования ДНК и реактивации репрессированных генов. Считается, что патологические паттерны метилирования ДНК определяют развитие миелодиспластических синдромов высокого риска и острого миелоцитарного лейкоза, а гипометилирование может восстанавливать нормальную функцию генов, контролирующих дифференцировку и пролиферацию [15–17]. После 16 лет клинического применения 5-азацитидина он остается основным препаратом для лечения МДС и ОМЛ. Однако точный механизм его действия все еще до конца не изучен [17]. В нашей работе было показано, что 5-азацитидин подавляет транскрипцию с тканеспецифического L-промотора гена POU2F1 и избирательно снижает экспрессию изоформы Oct-1L в два-три раза при концентрациях, используемых в клинической практике.

Мы провели анализ области альтернативного промотора L гена POU2F1 и не обнаружили там CpG-островков, которые могли бы подвергаться метилированию, поэтому мы полагаем, что обнаруженный нами эффект 5-азацитидина не связан с деметилированием промотора L. Возможно, деметилированию подвергаются более отдаленные участки гена POU2F1, регулирующие транскрипцию тканеспецифического промотора, или проявляются другие свойства 5-азацитидина, не связанные с деметилированием.

При лечении онкологических заболеваний следует обратить внимание на следующие факты: 1) высокий уровень экспрессии Oct-1 осложняет течение заболевания при таких гематологических опухолях, как ОМЛ, диффузная В-крупноклеточная лимфома, лимфома Ходжкина, лимфома тимуса; 2) искусственно вызванная гипоэкспрессия Oct-1 при ОМЛ задерживает развитие лейкоза; 3) в В- и Т-клеточных лимфомах (линии клеток Namalwa, Raji, Jurkat) наблюдается аномально высокая экспрессия изоформы Oct-1L, нехарактерная для нормальных лимфоидных клеток; 4) в некоторых опухолевых линиях клеток уровень экспрессии изоформы Oct-1L значительно превышает таковой у нормальных клеток того же происхождения [18]. Из совокупности этих данных можно сделать вывод, что аберрантная экспрессия тканеспецифической изоформы Oct-1L является фактором неблагоприятного прогноза и может стать терапевтической мишенью для опухолей, в которых наблюдается высокий уровень Oct-1. В этих случаях возможно применение в комбинированной терапии 5-азацитидина, избирательно подавляющего экспрессию изоформы Oct-1L. Это предположение требует дальнейшего анализа экспрессии изоформ Oct-1 в первичных опухолях.

Из клинической практики известно, что монотерапия 5-азацитидином эффективна при лечении МДС и ОМЛ. Однако в настоящее время нет достаточных доказательств в поддержку применения 5-азацитидина при лечении солидных опухолей или других гематологических злокачественных новообразований. Единственная попытка применения 5-азацитидина для лечения солидных опухолей была предпринята в 1977 г. Противоопухолевый эффект наблюдался только у 17% обследованных пациентов с карциномой груди и у 21% пациентов со злокачественными лимфомами. В результате был сделан вывод, что препарат неэффективен при солидных опухолях [15]. Однако исследования последних лет показали, что опухоли следует разделять по уровню экспрессии Oct-1. Сверхэкспрессия Oct-1 коррелирует с агрессивностью опухоли при раке груди, пищевода, желудка, простаты, легких, головы и шеи, шейки матки, колоректального рака, диффузной В-крупноклеточной лимфомы и других злокачественных опухолей [1, 8]. Возможно, положительный противоопухолевый эффект 5-азацитидина в исследовании 1977 г. наблюдался именно у пациентов со сверхэкспрессией Oct-1L в опухоли.

Наши результаты подтверждают важность детального анализа экспрессии генов как стратегии выявления новых биомаркеров и терапевтических мишеней при лимфомах и лейкозах. Способность 5-азацитидина подавлять экспрессию Oct-1L в опухолевых клетках может стать важным шагом для его применения при лечении опухолей с повышенным уровнем экспрессии Oct-1L.