Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 503, № 1, стр. 138-143

Проблема повышения устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии является одной из наиболее важных задач современной кардиологии, патофизиологии, экспериментальной и клинической фармакологии. Следует отметить, что ишемия длительностью более 10–15 мин сопровождается необратимыми изменениями в кардиомиоцитах и, как следствие, их гибелью, даже в случае возобновления нормальной оксигенации. Постишемическое восстановление кровотока после длительной (30–60 мин) ишемии не только не возвращает метаболические процессы на доишемический уровень, но и усугубляет гипоксическое повреждение отдельных кардиомиоцитов [1, 2]. Учитывая вышесказанное, вполне очевидным является поиск препаратов, предупреждающих развитие ишемических и реперфузионных повреждений при инфаркте миокарда.

Ранее было показано, что повышенная активность блуждающего нерва оказывает кардиопротективное действие против реперфузионного повреждения миокарда, а ацетилхолин (ACh), основной нейротрансмиттер блуждающего нерва в сердце, воспроизводит кардиопротективные эффекты. Активация нейронных или не-нейронных холинергических путей, уменьшающих ишемическое повреждение, происходит посредством двух видов холинорецепторов – мускариновых и никотиновых [3–5]. Мускариновые холинорецепторы относятся к семейству рецепторов, связанных с G-белком (GPCRs – G protein-coupled receptors), а никотиновые к семейству лиганд-управляемых ионных каналов, и оба вида холинорецепторов присутствуют в сердце [6]. В зависимости от субъединичного состава существует несколько типов никотиновых холинорецепторов (нХР). Установлено, что активация нХР миокарда, в частности, нХР типа α7, во время ишемического повреждения может обеспечить терапевтическую защиту, улучшая сократительную функцию сердца и ограничивая размер инфаркта [7].

Ранее мы показали, что L-6-бромогипафорин (рис. 1), бром-содержащий аналог индола, является избирательным агонистом нХР типа α7 [8]. Нами получен ряд синтетических аналогов D-6-бромогипафирина, в которых атом брома заменен на другие электронакцепторные заместители (синтез и физико-химические характеристики будут опубликованы отдельно). Некоторые из полученных соединений, в частности аналоги 6ND и 6ID, продемонстрировали более высокую активность как агонисты нХР типа α7, чем природный L-6-бромогипафорин. В данной работе нами проведено исследование двух синтетических аналогов D-6-бромогипафорина (6ND и 6ID) с целью выявления их терапевтического потенциала для уменьшения реперфузионного повреждения после перенесенной ишемии миокарда у экспериментальных животных.

Рис. 1.

Структурная формула 6-бромогипафорина (R = Br) и аналогов 6ND и 6ID (R – электроноакцепторный заместитель). * – асимметрический атом углерода, имеющий L-конфигурацию в 6-бромогипафорине и D-конфигурацию в аналогах 6ND и 6ID.

В опытах использовали самцов крыс аутбредной линии Sprague-Dawley (НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН) возрастом 9–11 нед и массой 220–280 г. Все процедуры были одобрены комиссией ФИБХ РАН по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных (протокол-заявка №766/20). Для наркотизации использовали уретан (1.5 г/кг внутрибрюшинно). Животным воспроизводили острый инфаркт миокарда путем окклюзии левой коронарной артерии (ЛКА) с ее последующей реперфузией при искусственной вентиляции легких с частотой дыхания 60–65 в минуту и дыхательным объемом 10 мл на 1 кг массы тела (Rodent Ventilator UGO BASILE 7025). Для введения тестируемых веществ и метиленового синего имплантировали катетер в яремную вену, для сбора крови – в правую сонную артерию. Доступ к коронарному сосуду производили путем торакотомии в четвертом межреберье слева. Вскрывали перикард, определяли локализацию общего ствола левой коронарной артерии (ЛКА), под который с помощью атравматической иглы подводили тонкую полиамидную нить (ETHILON 6–0). Для создания обратимой ишемии миокарда из полиэтиленовой трубки РЕ-10 формировали окклюдер [9]. Во время проведения эксперимента поддерживали температуру тела животных на уровне 37 ± 1°C с помощью термостатируемой поверхности.

Для оценки кардиопротективных свойств агонистов α7 нХР животных подвергали 30-минутной окклюзии ЛКА с последующей 90-минутной реперфузией. В момент снятия окклюдера, на первой минуте реперфузии крысам вводили внутривенно 6ND (n = 8) или 6ID (n = 7) в дозах 0.05 мг/кг. Проведенные ранее в лаборатории биологических испытаний ФИБХ РАН исследования показали, что оба соединения в такой дозе снижали воспаление у экспериментальных животных (полученные результаты будут опубликованы отдельно). Объем введения составлял 1 мл на кг веса животного. Контролем (n = 5) служили животные, которым вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме. Определение размеров анатомической зоны риска и зоны инфаркта производили с помощью методики “двойного окрашивания” 2% метиленовым синим и 1% хлоридом трифенилтетразолия (ТТХ) [10]. После окончания реперфузии вокруг коронарной артерии вновь затягивали лигатуру и внутривенно вводили раствор метиленового синего до визуализации границы между кровоснабжаемыми и ишемизированными отделами. Далее сердце быстро удаляли, отмывали в физиологическом растворе и разрезали в поперечном направлении на пять срезов одинаковой толщины. Полученные срезы инкубировали в течение 15 мин в растворе ТТХ при температуре 37°C и рН 7.4, затем фиксировали 5 мин в 10% формалине. Окрашенные срезы сканировали на сканере HP Laser Jet 3055 и обрабатывали полученные изображения с использованием программы Image TOOL. В каждом срезе подсчитывались зона инфаркта (неокрашенная ТТХ, находящаяся в пределах зоны риска), зона риска (окрашенная ТТХ) и площадь среза левого желудочка (для определения площади анатомической зоны риска). Общую площадь зоны инфаркта вычисляли по пяти срезам и представляли в процентном отношении от общей площади зоны риска. Затем таким же способом, как и в случае зоны инфаркта, вычисляли долю площади анатомической зоны риска от общей площади левого желудочка для данного сердца.

Кровь в объеме 0.5 мл собирали из артериального катетера до момента окклюзии (исходные значения), а также в конце реперфузионного периода (после окклюзии-реперфузии). Анализ ионов (K⁺, Na⁺) выполняли с помощью анализатора электролитов EX-D фирмы JOKOH CO, LTD.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 7 for Windows. Данные представляли в виде “среднее ± ± стандартное отклонение”, изменения исследуемых показателей считали статистически значимыми при p < 0.05.

Определение анатомической зоны риска (ЗР) у трех групп животных, контрольных и получавших 6ND или 6ID, не выявило отличий, ее размеры составили 33.7 ± 7.1, 35.6 ± 5.6 и 30.8 ± 11.4%, соответственно, от общей площади левого желудочка, что свидетельствует об одинаковом объеме миокарда, подвергшегося ишемии. В то же время размер зоны инфаркта (ЗИ) различался в контрольной группе и группах, которым вводили исследуемые аналоги 6-бромогипафорина (рис. 2). Так, введение 6ND на первой минуте реперфузии приводило к статистически достоверному снижению размера инфаркта до 26.8 ± 11.5% от зоны риска по сравнению с контролем, в котором эта величина составила 43.2 ± 8.8% (рис. 3). Введение 6ID также оказывало инфаркт-лимитирующее действие (33.3 ± 12.3%), однако менее эффективно.

Рис. 2.

Примеры послойных срезов левого желудочка крыс из контрольной и экспериментальных групп. Бледно-желтые участки зоны инфаркта (не окрашенные ТТХ) находятся в пределах зоны риска, окрашенной ТТХ в ярко кирпичный цвет. Неишемизированный миокард окрашен в темно-синий цвет.

Рис. 3.

Размер зоны инфаркта (ЗИ), выраженный в процентах от зоны риска (ЗР) в экспериментальных группах. * p < 0.05 относительно группы “Контроль” согласно t-тесту Стьюдента для независимых выборок.

Определение содержания электролитов в крови животных выявило изменение концентрации ионов калия и натрия после окклюзионно-реперфузионного повреждения (рис. 4). Так, в контрольной группе наблюдались повышение уровня ионов калия на 19% относительно исходных значений и компенсаторное снижение ионов натрия на 4%, однако это изменение не было статистически значимым. Подобные изменения концентраций наблюдались в группе, получавшей 6ID, тогда как при введении 6ND изменения концентраций ионов были минимальными (снижение концентрации ионов натрия на 0.4%, рис. 3), что свидетельствует о защитном действии соединения 6ND.

Рис. 4.

Изменения концентраций ионов натрия (а) и калия (б) после окллюзионно-реперфузионного повреждения. * p < 0.05 относительно группы “Контроль в конце реперфузии” согласно t-тесту Стьюдента для несвязанных выборок. ** p < 0.05 относительно исходных значений согласно t-тесту Стьюдента для cвязанных выборок.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что активация нХР ведет к усилению клеточной пролиферации и выживаемости клеток [11, 12]. Тот факт, что активация нХР способствует клеточной пролиферации, позволяет предположить, что агонисты этих рецепторов могли бы применяться для улучшения регенерации тканей и защиты от клеточной гибели. Действительно, никотин и другие агонисты нХР оказывали защитный эффект в отношении нейронов при нейродегенеративных расстройствах [13, 14]. Особый интерес представляют нХР типа α7, так как эти рецепторы экспрессируются различными типами клеток, включая, в частности, иммунные клетки [15] и нейроны [16, 17]. Кроме того, эти рецепторы являются высокопроницаемыми для ионов кальция, что подразумевает их значительную роль в активации внутриклеточных процессов. Ранее было установлено, что активация α7 нХР на макрофагах приводит к снижению выброса ими провоспалительных цитокинов за счет ингибирования сигнального каскада с участием ядерного фактора κB (NF-κB) [18]. С другой стороны, в экспериментах на различных клетках активация нХР вызывала снижение концентрации активных форм кислорода. Возможно, ответственным за этот эффект является путь, включающий активацию α7 типа нХР и гемоксигеназы-1 – фермента, обусловливающего сильный антиоксидантный и антивоспалительный эффект [19]. Как уже отмечалось, активация нХР типа α7 во время ишемического повреждения ограничивает размер инфаркта [7]. Наши данные подтверждают кардиопротекторный эффект активации α7 нХР и показывают наличие такой активности у новых синтетических аналогов 6-бромогипафорина, являющихся селективными агонистами этого типа нХР.

При моделировании острого инфаркта миокарда у экспериментальных животных развиваются повреждения не только наружной клеточной мембраны, но и мембранных структур клеточных органелл, что ведет к мышечной слабости и дисфункции миокарда с последующей фибрилляцией или асистолией желудочков [20]. Выявленная гиперкалиемия у контрольных животных подтверждает аномальный выход ионов во внеклеточное пространство вследствие гибели кардиомиоцитов. Введение 6ND предотвращало развитие этого процесса, снижая, по-видимому, активацию апоптических путей. Также в реперфузионном периоде происходит активация натрий-зависимых регуляторных механизмов – Na⁺/H⁺ обменника и Na⁺/HCO3^– котранспортера, приводящая к возрастанию внутриклеточной концентрации ионов натрия. Нами было обнаружено незначительное повышение (0.4%) концентрации ионов натрия при введении соединения 6ND; в контрольной группе и группе, получавшей 6ID, сывороточный уровень натрия снижался на 4%. Эти данные свидетельствуют о положительном эффекте соединения 6ND.

Таким образом, результаты наших исследований позволяют сделать вывод, что введение агониста α7 нХР 6ND в раннем реперфузионном периоде уменьшает размер инфаркта миокарда, повышая резистентность кардиомиоцитов к ишемическим/реперфузионным повреждениям.