Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 505, № 1, стр. 303-309

Нейротрофин-3 (NT-3), наряду с фактором роста нервов (NGF) и мозговым нейротрофическим фактором (BDNF), играет важную роль в регуляции пролиферации, дифференцировки, миелинизации, поддержании жизнеспособности и фенотипической стабильности нейронов. В отличие от других нейротрофинов, NT-3 взаимодействует со всеми типами Trk рецепторов, активируя преимущественно TrkC, с меньшей аффинностью TrkB и с еще более низкой – TrkA [1]. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о высоком терапевтическом потенциале NT-3 для лечения неврологических и психических нарушений, таких как церебральная ишемия, тревожные расстройства, шизофрения, депрессия и др. [2, 3]. В частности, антидепрессантоподобные эффекты NT-3 при введении в зубчатую извилину гиппокампа крыс выявлены в тестах выученной беспомощности и вынужденного плавания [4]. Однако разработка фармакологических препаратов на основе полноразмерных нейротрофинов ограничена в связи с их макромолекулярной белковой природой, плохим проникновением через гематоэнцефалический барьер и низкой устойчивостью в биологических средах. Поэтому альтернативой является создание низкомолекулярных миметиков нейротрофинов.

Целью данной работы было создание фармакологически активного дипептидного миметика NT-3.

По сравнению с NGF и BDNF, число низкомолекулярных миметиков NT-3, известных к настоящему времени, невелико. Так, канадской группой исследователей под руководством Бёрджесса (K. Burgess) и Сарагови (U.H. Saragovi) получены моновалентные миметики-частичные агонисты NT-3 на основе гетероциклических бета-поворотных шаблонов, включающих в себя дипептидные последовательности из первичной структуры NT-3 [5, 6]. Ими же синтезирован ряд бивалентных миметиков NT-3, содержащих в своей структуре фрагменты боковых радикалов аминокислотных остатков (а.к.о.), входящих в состав β-изгибов NT-3 [7, 8]. Поворотная конформация в этих соединениях закреплена с помощью триазольного кольца. Эти миметики активировали TrkC и проявляли нейропротекторный эффект in vitro [6, 8].

Однако в доступной литературе мы не обнаружили данных о фармакологических эффектах низкомолекулярных миметиков NT-3 in vivo.

Ранее в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова в целях создания фармакологических средств, обладающих свойствами NGF и BDNF, была предложена стратегия поиска димерных дипептидных миметиков нейротрофинов [9, 10], основная идея которой заключается в конструировании N-ацилдипептидных миметиков бета-поворотных фрагментов петель нейротрофина со стабилизацией поворотной конформации с помощью внутримолекулярной водородной связи между карбонилом N-ацильной группы и NH-группой С-концевого амида. При этом N-ацильная группа представляла собой биоизостер предшествующего а.к.о. Димерная структура нейротрофина имитировалась путем димеризации дипептида олигометилендиамином по С-концу.

Для дизайна миметика NT-3 использовали пространственную информацию из его кристаллической структуры (pdb ID: 1NT3) (рис. 1). Подобно другим членам нейротрофинового семейства NT-3 представляет собой симметричный гомодимер, мономерные единицы которого содержат 7 бета-тяжей, образующих три антипараллельных β-листа. β-Тяжи связаны четырьмя экспонированными наружу нерегулярными участками, называемыми петлями: 1-я (остатки 29–33),   2-я   (42–47),   3-я   (остатки   58–75)  и 4-я (91–97). Наиболее экспонированной является 4-я петля, фрагмент которой –Ser⁹¹–Glu⁹²–Asn⁹³–Asn⁹⁴–Lys⁹⁵–Leu⁹⁶– содержит в своей структуре серию поворотных участков. Для конструирования миметика нами был выбран фрагмент –Glu⁹²–Asn⁹³–Asn⁹⁴– как наиболее экспонированный и поэтому предположительно занимающий геометрически наиболее выгодное для взаимодействия с рецептором положение. При конструировании мы сохраняли дипептидный фрагмент –Asn⁹³–Asn⁹⁴– как центральный фрагмент бета-поворот-подобного участка, а предшествующий а.к.о. Glu⁹² заменяли на его биоизостер – остаток янтарной кислоты. Димерную структуру нейротрофина воспроизводили с помощью гексаметилендиаминового спейсера. Таким образом, на основе структуры 4-й петли был сконструирован димерный дипептидный миметик NT-3, гексаметилендиамыид бис-(N-моносукцинил-L-аспарагинил-L-аспарагина) (ГТС-301) (рис. 1).

Рис. 1.

Структура гомодимера нейротрофина-3 (pdb ID: 1NT-3) и миметик ГТС-301.

ГТС-301 синтезировали методами классического пептидного синтеза в растворе с использованием Boc-стратегии защитных групп и метода активированных пентафторфениловых эфиров, пептидную цепь наращивали с С-конца. Очистку проводили ОФ ВЭЖХ (Luna C18 50 × 250 мм, градиент 0–6% изопропанола в 0.1 М уксусной кислоте, 210 нм). Пептид ГТС-301 был хроматографически гомогенным по данным ТСХ и ОФ ВЭЖХ. Структура подтверждена ¹Н- и ¹³С-ЯМР-спектроскопией и электроспрей-ионизационной масс-спектрометрией. Найдено, m/z: 773.34 [M + H] +; m/z: 771.33 [M – H] –. C₃₀H₄₈N₁₀O₁₄. Рассчитано, m/z: 772.77. Диастереомерная чистота дипептида ГТС-301 по данным ЯМР составила не менее 98%.

Для выявления потенциала ГТС-301 как миметика NT-3, анализировали нейропротекторную активность соединения in vitro, способность активировать Trk рецепторы и антидепрессантоподобные свойства на экспериментальной модели in vivo.

Нейропротекторную активность ГТС-301 определяли в условиях окислительного стресса и глутаматной токсичности на клетках гиппокампа мыши HT-22 как описано ранее [11]. NT-3 (100 нг/мл, 3.4 ⋅ 10^–9 M) либо ГТС-301 (10^–13–10^–5 M) вносили в среду за 24 ч до повреждения. Жизне-способность   клеток определяли с помощью МТТ-теста.

На модели окислительного стресса ГТС-301 статистически значимо увеличивал жизнеспособность клеток в интервале концентраций 10^–5–10^–12 М, при моделировании глутаматной токсичности – в диапазоне концентраций 10^–5–10^–8 М (табл. 1). В обоих опытах максимальный эффект ГТС-301 в 66–68% от наблюдаемого для NT-3 зарегистрирован в концентрации 10^–6 М.

Способность ГТС-301 активировать разные Trk рецепторы изучена методом Вестерн-блот анализа на культуре клеток HT-22 с использованием моноклональных антител к фосфорилированным формам pTrkA(Y490), pTrkB(Y515) и pTrkC(Y516). Выбор антител основан на литературных данных о механизмах активации пострецепторных сигнальных путей PI3K/AKT и MEK/MAPK/ERK [12]. В качестве контроля использовали антитела к нефосфорилированным TrkA, TrkB и TrkC. Пробы лизировали через 5, 15, 30, 60 и 180 мин после внесения NT-3 (100 нг/мл) или ГТС-301 (10^–6 М). Временные интервалы выбраны исходя из результатов экспериментов по фосфорилированию Trk дипептидными миметиками NGF и BDNF [13].

Активация TrkC, наиболее предпочтительного для NT-3, выявлена через 15, 30 и 180 мин инкубации с ГТС-301, и через 5 и 15 мин инкубации с NT-3, при этом через 15 мин наблюдали сходные эффекты миметика и полноразмерного нейротрофина (рис. 2).

Рис. 2.

Активация TrkC рецептора после внесения NT-3 100 (нг/мл) и ГТС-301 (10^–6 М) в культуру клеток гиппокампа мыши линии HT-22. На рис. 2, 3 и 4 представлены оригинальные вестерн-блоты и результаты их денситометрии. Данные представлены в виде средних и стандартных отклонений (M±SD). Представленные данные являются средними значениями из трех независимых экспериментов. Достоверность отличий * p ≤ 0,05 – от контроля (U-тест Манна–Уитни).

Влияние ГТС-301 на TrkB было выявлено только в одной временной точке – через 180 мин, тогда как для NT-3 – через 5, 15, 60 и 180 мин после внесения. При этом выраженность активирующего влияния оказалась ниже, чем в случае TrkC рецепторов (рис. 3).

Рис. 3.

Активация TrkB рецептора после внесения NT-3 (100 нг/мл) и ГТС-301 (10^–6 М) в культуру клеток гиппокампа мыши линии HT-22.

NT-3 активировал TrkA рецептор через 180 мин, а ГТС-301 в этих условиях был неэффективен (рис. 4).

Рис. 4.

Сравнение активации TrkA рецептора после внесения NT-3 (100 нг/мл) и ГТС-301 (10^–6 М) в культуру клеток гиппокампа мыши линии HT-22.

Таким образом, ГТС-301 активирует более эффективно TrkC и, в меньшей степени, TrkB. Спектр активации Trk рецепторов миметиком ГТС-301 в целом повторяет таковой для полноразмерного NT-3. Полученная нами картина активации нейротрофином-3 тирозинкиназных рецепторов соответствует литературным данным [14].

Возможные антидепрессантоподобные эффекты ГТС-301 были изучены в тесте вынужденного плавания на мышах BALB/c. Тест проводили в модифицированной конфигурации с двумя посадками мышей в цилиндры с водой [15]. ГТС-301 в дозах 0.5–40 мг/кг вводили мышам субхронически (7 дней) внутрибрюшинно (в/б) в виде суспензии в растворе 1% Tween 80. В качестве положительного контроля использовали Амитриптилин (10 мг/кг, в/б, в физ. растворе). Контрольные мыши получали 1% раствор Tween 80. Спустя 24 ч после последнего введения препаратов проводили предварительную посадку мышей в цилиндры с водой на 10 мин, спустя еще 24 ч – 5-минутную тестовую посадку, в течение которой регистрировали время иммобильности.

Установлено, что в дозах 10–40 мг/кг ГТС-301 статистически значимо снижал время иммобильности мышей, что свидетельствует об антидепрессантоподобном эффекте дипептида (табл. 2). Выраженность эффекта ГТС-301 в дозах 20 и 40 мг/кг была такая же, как у классического антидепрессанта Амитриптилина.

Таким образом, сконструирован и синтезирован ГТС-301, димерный дипептидный миметик нейротрофина-3, активирующий преимущественно TrkC рецептор, проявляющий нейропротекторную активность в экспериментах in vitro в пикомолярных концентрациях и обладающий антидепрессантоподобной активностью при системном введении. ГТС-301, помимо вероятной практической значимости, может служить молекулярным инструментом для изучения рецепторных взаимодействий, сопряжения активации TrkC рецептора с сигнальными путями и фармакологических эффектов как для полноразмерного NT-3, так и для малых молекул, имитирующих влияние этого нейротрофина.