Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 505, № 1, стр. 258-262

Цинк является одним из наиболее важных микроэлементов, необходимых для нормальной жизнедеятельности человека. Во многом это связано с его ролью как структурного компонента или активатора более 300 ферментов, участвующих в обмене белков, углеводов и нуклеиновых кислот [1]. Кроме того, цинк является структурным элементом транскрипционных факторов с доменом “цинковые пальцы” (zinc finger), которые играют ключевую роль в регуляции экспрессии целого ряда генов. Поэтому дефицит цинка отрицательно сказывается на состоянии здоровья населения во многих регионах планеты, вызывая целый ряд заболеваний [2].

Как известно, в организм человека цинк поступает в основном с растительной пищей, поэтому наиболее эффективным и экономически оправданным подходом к решению проблемы дефицита этого микроэлемента считается повышение его содержания в зерне основных сельскохозяйственных культур за счет улучшения их генетических качеств, т.е. биофортификации [3, 4]. В настоящее время с использованием метода отдаленной гибридизации получены сорта (линии) мягкой пшеницы с улучшенными качествами зерна в отношении содержания в нем микроэлементов. Это стало возможным благодаря введению в различные сорта мягкой пшеницы (Triticum aestivum) функциональных аллелей гена Gpc-B1 (grain protein concentration) из T. dicoccoides [5]. Установлено, что этот ген кодирует белок NAC, принадлежащий к одному из специфичных для растений семейств NAC-факторов транскрипции, который регулирует процесс старения листьев и участвует в ремобилизации азота и ряда микроэлементов, включая цинк, из листьев в колос [6, 7]. Обнаружено, что растения с функциональным аллелем данного гена имеют более высокое содержание цинка в зерне, чем растения, у которых аллель этого гена нефункционален. Но чем обусловлены эти различия, пока не ясно. Поэтому в последнее время повышенное внимание уделяется изучению у злаков молекулярно-генетических механизмов, обеспечивающих поступление цинка в растение и его дальний транспорт в надземные органы, в том числе в семена.

На сегодняшний день известно, что в гомеостазе цинка (поддержании необходимого его количества) участвует более 1800 генов, среди которых наибольшее количество – это гены белков-переносчиков [8]. Среди них наиболее изученными являются белки из семейства ZIP (zinc-iron-regulated transporter). Например, показано, что при дефиците цинка заметно возрастает экспрессия генов белка ZIP1 в побегах пшеницы [9], белков ZIP 3/7/8/10/13 в корнях и побегах ячменя [10], ZIP5 и ZIP8 – в побегах кукурузы [11], что приводит к активизации поглощения этого микроэлемента корнями и увеличению его содержания как в подземных, так и в надземных органах.

Об участии других белков транспортеров в адаптации растений к дефициту цинка данных относительно немного. Вместе с тем известно, что в гомеостазе двухвалентных металлов важную роль играют белки, участвующие в дальнем транспорте ионов и осуществляющие их перенос через плазмалемму клеток в проводящие сосуды. К ним, в частности, относятся белки НМА2 (heavy metal ATPase2), относящиеся к Р_1В-типуАТФаз и осуществляющих загрузку ионов металлов, включая цинк, в ксилему и флоэму [12]. Участие НМА2-генов в гомеостазе цинка у злаков показано в целом ряде исследований [12, 13]. При этом обнаружено, что увеличение активности НМА2 транспортеров в условиях дефицита цинка может способствовать повышению его содержания в надземных органах и зерне.

Ранее нами было показано, что интрогрессивные линии мягкой пшеницы (T. aestivum cорт Фестивальная), созданные с участием T. dicoccoides, различаются аллельным статусом гена Gpс-B1 и, как следствие, содержанием цинка в зерне [14]. В частности, у растений линии 15-7-1, содержащей функциональный аллель этого гена, содержание цинка оказалось почти в 2 раза выше, чем у растений линии 15-7-2 с его нефункциональным аллелем, причем не только в оптимальных условиях минерального питания, но и при дефиците этого микроэлемента в субстрате. Различаются ли растения этих линий по активности транспортных белков, не известно, хотя в литературе имеются данные, свидетельствующие об участии NAC-белков в регуляции активности ряда белков транспортеров [15, 16].

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение уровня экспрессии гена ТаНМА2 в листьях растений пшеницы с разным функциональным статусом гена Gpc-В1, выращиваемых при оптимальном содержании цинка в корнеобитаемой среде и его дефиците.

В данном исследовании впервые установлено, что растения с функциональным аллелем гена Gpc-В1 характеризуются более высоким уровнем транскриптов гена TaHMA2, чем растения с его нефункциональным аллелем, причем как в оптимальных условиях минерального питания, так и при дефиците цинка в корнеобитаемой среде. И это корреспондировалось с более высоким содержанием цинка в надземных органах растений.

Растения пшеницы выращивали в условиях вегетационного опыта в песчаном субстрате в сосудах (объемом 6 л). Плотность посева – 12 растений на сосуд. Полив растений контрольного варианта осуществляли питательным раствором Хогланда-Арнона, в котором содержалось 2 мкМ цинка в виде его сернокислой соли (Zn оптимум). В опытных вариантах соль цинка в питательный раствор не вносили (Zn дефицит). Как показал химический анализ, содержание цинка в нем было менее 0.5 мкМ. В фазу созревания семян у растений измеряли высоту и сухую биомассу побега. В флаговых листьях измеряли содержание транскриптов гена ТаНМА2. Помимо этого в побегах определяли содержание цинка.

Тотальную РНК выделяли с помощью набора ExtractRNA (“Евроген”, Россия). Для удаления остатков  ДНК  препарат  РНК  обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) (“Синтол”, Россия). кДНК синтезировали, используя наборы для обратной транскрипции с М-MLV обратной транскриптазой и случайными (random) гексапраймерами (“Евроген”). Количество и качество выделенной РНК и синтезированной кДНК проверяли спектрофотометрически на приборе SmartSpecPlus (“Bio-Rad”). Амплификацию образцов проводили в приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 (“Bio-Rad”), используя наборы для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green (“Евроген”). В качестве референсного гена использовали actin. Для проведения ПЦР использовали праймеры компании “Евроген”: Actin – номер в базе данных NCBI AG579382 (f – 5'-ggtcgtgaccttactgatgc-3', rev –5'-caatagaggaactgctctttgc-3'), TaHMA2 – номер в базе данных NCBI GF489141 (f – 5'-gttcatcgtcttcctcttcac, rev – 5'- atcttcacatcctgggtagc- 3'). Протокол ПЦР: 5 мин при 95°С, далее 45 циклов 15 с при 95°С, 30 с при 56°С. Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР фрагментов. Накопление транскриптов генов вычисляли по ΔΔС_т [17]. В качестве контрольного образца использовали кДНК растений T. aestivum с. Фестивальная. Содержание цинка измеряли на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА-7000 (Shimadzy, Япония). В каждом варианте опыта измерения проводились на 3–10 растениях (биологическая повторность) в зависимости от показателя, аналитическая повторность была 2–4-кратной. Статистическую значимость различий между средними оценивали на основании t-критерия Стьюдента. В статье обсуждаются только величины, статистически значимые при р < 0.05.

Проведенные исследования показали, что в оптимальных условиях минерального питания содержание транскриптов гена TaHMA2 во флаговых листьях растений линии 15-7-1, имеющих функциональный аллель гена Gpc-В1, было более, чем в 7 раз выше, чем у растений линии 15-7-2, содержащих нефункциональный аллель этого гена. При недостатке цинка в корнеобитаемой среде оно возрастало у растений обеих линий, причем у линии 15-7-2 даже в большей степени, но тем не менее оставалось при этом гораздо ниже (почти в 5 раз), чем у линии 15-7-1 (рис. 1).

Рис. 1.

Содержание транскриптов гена TaHMA2 в листьях пшеницы при оптимальном содержании цинка в корнеобитаемой среде и его дефиците. За единицу принято содержание транскриптов гена в листьях T. aestivum с. Фестивальная.

Имеющиеся в литературе сведения о зависимости между уровнем экспрессии гена НМА2 и ростом растений носят противоречивый характер. Так, hma2-мутантные растения риса [13] и арабидопсиса [12] с нарушенной экспрессией гена НМА2 заметно отставали в росте от дикого типа, при этом и содержание цинка в надземных органах у них было более низким. В то же время растения табака и пшеницы со сверхэкспрессией гена НМА2 не отличались от дикого типа по росту вегетативных и генеративных органов, но содержали больше цинка в корнях и побегах [18].

В наших опытах, несмотря на значительные различия в экспрессии гена TaHMA2 между растениями изученных линий, разницы в изученных показателях роста побега у них не наблюдалось, причем независимо от содержания цинка в корнеобитаемой среде (табл. 1). Однако при этом содержание металла в побегах у растений изученных линий заметно различалось и было выше у растений линии 15-7-1 по сравнению с линией 15-7-2 как в условиях оптимального содержания цинка в субстрате, так и при его дефиците (табл. 2).

Поиск возможных путей биофортификации зерна пшеницы цинком является одной из важнейших селекционно-генетических задач, направленных на устранение дефицита этого микроэлемента в организме человека. Перспективным путем ее решения является создание с использованием метода отдаленной гибридизации сортов (линий) пшеницы, имеющих в геноме функциональный аллель гена Gpc-В1 (от T. dicoccoides). В целом ряде исследований показано, что растения с функциональным аллелем этого гена отличаются более высоким содержанием цинка в зерне по сравнению c растениями, у которых аллель этого гена не функционален, что связано с лучшей ремобилизацией цинка из листьев в зерно. Поскольку дальний транспорт цинка по растению осуществляется с помощью транспортных белков, крайне важным является изучение роли этих белков и кодирующих их генов в обеспечении зерна данным микроэлементом [19]. В литературе есть сведения, указывающие на участие гена НМА2 в обеспечении растений цинком. Например, выявлено, что у растений риса со сверхэкспрессией гена НМА2 возрастало по сравнению с диким типом содержание микроэлемента в надземных органах, что положительно сказывалось на скорости формирования семян [18]. В наших опытах более высокий уровень экспрессии гена TaHMA2 в листьях пшеницы линии 15-7-1 также соответствовал более высокому содержанию цинка в побегах растений, что особенно отчетливо проявилось в условиях его дефицита в корнеобитаемой среде. При этом торможение роста побегов не наблюдалось.

В литературе имеются также сведения о том, что у T. aestivum белок GPC1 связан с изменениями уровней экспрессии нескольких транспортеров цинка, включая ZIP и YSL [15]. Помимо этого обнаружено, что у растений T. durum сорта US1114, имеющих в своем геноме ген Gpc-В1, при обработке флаговых листьев сульфатом цинка возрастал уровень экспрессии гена НМА, регулирующего экспорт цинка из хлоропластов в цитоплазму, а также генов транспортных белков ZIP1/15. При этом у растений сорта MACS3125, не имеющих гена Gpc-В1, подобный эффект отсутствовал [20]. Наши результаты показали, что содержание транскриптов гена НМА2 у растений с функциональным аллелем гена Gpc-В1 значительно выше, чем у растений с его нефункциональным аллелем. Анализ литературы и полученных нами данных позволяет высказать предположение, что ген Gpc-В1, кодирующий NAC фактор транскрипции, участвует в регуляции экспрессии гена НМА2.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами впервые установлены различия в экспрессии гена транспортного белка HMA2 в листьях растений пшеницы, различающихся аллельным статусом гена Gpc-В1. У растений с функциональным аллелем гена Gpc-В1 содержание транскриптов гена TaHMA2 оказалось значительно выше, чем у растений с его нефункциональным аллелем, причем как в оптимальных условиях минерального питания, так и при дефиците цинка. Это соответствовало более высокому содержанию цинка в побегах, но не отражалось на росте побега. Предполагается, что белок NAC, кодируемый геном Gpc-В1, может участвовать в регуляции уровня экспрессии гена ТаНМА2.

Следует также еще раз отметить, что эффекты, связанные с наличием у растений функционального аллеля гена Gpc-В1, изучены пока крайне слабо. Однако поскольку такие растения являются перспективными с точки зрения биофортификации зерна пшеницы цинком и могут рассматриваться в качестве потенциального источника для улучшения качественных показателей зерна, то изучение этих эффектов, как в плане феноменологии, так и механизмов, лежащих в их основе, требуют проведения дальнейших исследований.