Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 505, № 1, стр. 314-317

Сохранение и поддержание численности популяций многих видов рыб в настоящее время возможны только с помощью искусственного воспроизводства, особенно это касается рыб с длинным циклом развития, таких как осетровые.

К настоящему времени на предприятиях по воспроизводству, восстановлению природных популяций рыб и фермах по товарному производству создают маточные стада, проводят искусственное оплодотворение икры и выращивают молодь, которую затем выпускают в естественные водоемы или используют для дальнейшего выращивания товарного продукта. Однако использование ограниченного количества производителей из маточного стада приводит к инбридингу (близкородственному скрещиванию) и негативным образом влияет на получаемое потомство.

В связи с этим перспективным направлением на сегодняшний день остается криоконсервация репродуктивных клеток рыб с последующим использованием их в целях искусственного воспроизводства видов. Наличие криобанка репродуктивных клеток рыб позволяет сократить расходы на содержание недоброкачественных производителей, дает возможность использовать репродуктивные клетки в любое удобное время, а также проводить обмен образцами генетического материала между предприятиями.

В настоящее время разработаны методики низкотемпературного консервирования репродуктивных клеток, в частности спермы, достаточно большого количества рыб. Однако не всегда удается получать стабильные результаты по выживаемости дефростированных сперматозоидов, что указывает на необходимость проведения дальнейших исследований в этой области и определяет перспективность этого направления.

Одним из вариантов улучшения качества криоконсервированных репродуктивных клеток является воздействие на них в процессе низкотемпературного консервирования факторов различной природы (механических, химических, физических). В результате улучшается проникновение протекторов внутрь клеток, повышается их защитное действие, и, в конечном итоге, увеличивается процент выживаемости спермиев.

Большинство работ, направленных на использование различных воздействий на сперму для улучшения ее репродуктивных качеств, проведено на сельскохозяйственных животных. А.Н. Калгин (2008) [1] предлагает использовать одиночный кратковременный электроимпульс напряжением 1.5 В; Н.П. Кунденко (2012) [2] описывает установки на основе открытых резонаторов, образованных сферическим и плоским зеркалами, которые используются для воздействия акустическими колебаниями на микрообъекты животных перед их криоконсервацией; разработаны способ криоконсервации биологических образцов под давлением и устройство для его осуществления [3]. Ряд работ [4–6] посвящены воздействию ультразвуковых волн для оптимизации условий низкотемпературного консервирования спермы сельскохозяйственных животных.

В 2021 г. Южный научный центр Российской академии наук совместно с Донским государственным техническим университетом начал исследования по акустико-механическому воздействию на сперму рыб с использованием пьезоактуаторов.

Пьезоактуаторы – это специальные сверхпрецизионные короткоходные линейные электроприводы. Они преобразуют электрическую энергию в небольшое, но крайне точно контролируемое линейное перемещение с высоким развиваемым усилием. В основе принципа их действия лежит обратный пьезоэлектрический эффект, т.е. механическая деформация кристалла (пьезокерамики) при воздействии на него электрического поля. При этом осуществляется возвратно-поступательное движение или другие его виды.

Нами впервые предложено применение акустико-механического воздействия на замораживаемый материал, что, как мы считаем, позволит увеличить сохранность клеток во время двойного температурного шока. Это позволит ускорить проникновение криозащитных веществ через клеточные мембраны, предположительно снизив период эквилибрации, тем самым уменьшив время взаимодействия клеток с токсичными криопротекторами, и повысить выживаемость. Биологические эффекты акустико-механических воздействий, проводимых в период эквилибрации, обусловлены, вероятно, изменением проницаемости мембран клеток сперматозоидов рыб, увеличивается скорость диффузии раствора криопротектора внутрь клеток, поток ионов K+ из клетки вовне в результате облегчения пассивной диффузии и смещение глобул белков, расположенных на поверхности мембран.

Пьезоактуатор [7, 8] представляет собой круглую пластину диаметром 0.02 м. Пластина приклеена с внешней стороны по центру ко дну стандартного стеклянного лабораторного низкого градуированного стакана B-1-50 XC. Стакан имеет следующие размеры: объем 50 мл, диаметр 38 ± ± 1.0 мм, высота 70 ± 2 мм.

Суспензия заполняет стакан примерно на одну треть его высоты и имеет температуру около 4°С. Эксперимент проводится при комнатной температуре (рис. 1).

Рис. 1.

Экспериментальная установка для акустико-механического воздействия на сперму рыб.

Рабочим элементом пьезоактуатора является пьезоэлемент из пьезокерамики PZT-4 толщиной 0.003 м, предварительно поляризованный по толщине. Лицевые поверхности пьезоактуатора электродированы способом вжигания серебра и к ним подведены электрические провода. Толщиной нанесенных электродов пренебрегаем ввиду их малости. Внешняя поверхность электродов покрыта эпоксидной смолой толщиной 0.001 м, выполняющей роль защитного слоя.

По электрическим проводам на электроды подается переменная разность потенциалов по гармоническому закону с амплитудой V₀.

Дно стакана и пьезоэлемент образуют полупассивный биморф, поэтому приложение переменной разности потенциалов на электроды пьезоэлемента приводит к поперечным колебаниям дна емкости. Это вызывает установившиеся колебания пьезоактуатора и соответственно стакана. Создаваемое акустическое поле в суспензии в свою очередь приводит к акустическому воздействию на репродуктивные клетки рыб. При этом рабочей частотой является первая частота изгибных колебаний дна емкости.

В качестве объекта исследований использовали репродуктивные клетки самцов стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758) Биоресурсной коллекции редких и исчезающих видов рыб ЮНЦ РАН № 73602.

После получения половых продуктов самцов рыб и доставки их в лабораторию оценивают качество спермы. Для этого на предметное стекло помещают каплю спермы и смешивают с речной водой в соотношении 1 : 200. Под микроскопом оценивают процентное соотношение сперматозоидов с поступательным и колебательным движением по шкале Г.М. Персова, а также устанавливают время подвижности спермиев с помощью секундомера. Затем приступают к процессу криоконсервации: разбавление спермы криосредой в соотношении 1 : 1, эквилибрация в течение 40 мин, замораживание с применением программируемого замораживателя, хранение образцов в жидком азоте, размораживание и оценка качества дефростированного материала [9, 10].

При проведении экспериментальных работ перед эквилибрацией проводилось акустико-механическое воздействие с заданными параметрами.

Экспериментальная установка, предназначенная для возбуждения акустических волн в жидкостях, состоит из следующих элементов: пробирка с наклеенным на нее пьезоэлектрическим преобразователем, функциональный генератор сигналов Tektronix AFG 3022B, усилитель сигнала на основе пьезодрайверов и осциллограф LeCroy Wavesurfer 422. С помощью функционального генератора формируется синусоидальная волна с заданной частотой и амплитудой. Затем этот сигнал подается на усилитель и далее на пьезопреобразователь. Преобразователь представляет собой диск, изготовленный из пьезокерамического материала, который за счет пьезоэлектрического эффекта позволяет преобразовывать электрический сигнал в механические колебания. Последние, в свою очередь, передаются пробирке и жидкости, находящей внутри нее. Между преобразователем и усилителем подключен в параллель осциллограф, позволяющий контролировать выходные характеристики усиленного сигнала.

В экспериментах использовали следующие параметры акустико-механического воздействия на икру стерляди: 20 Гц (А), 500 Гц (В), 5.8 кГц (С), напряжение 10–15 В, время воздействия составило 1 мин. В результате улучшается проникновение криопротектора внутрь половых клеток и в конечном итоге после дефростирования качество спермы значительно повышается. Результаты представлены на рис. 2.

Рис. 2.

Подвижность дефростированных сперматозоидов стерляди, %, 20 Гц (А), 500 Гц (В), 5.8 кГц (С), напряжение 10–15 В, время воздействия – 1 мин.

В результате акустико-механического воздействия на сперму стерляди отмечено, что разные параметры времени, частоты и длины волны могут оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на репродуктивные качества дефростированных спермиев. Отмечено, что при увеличении времени воздействия выше 2 мин и частоты до 5 кГц и изменение длины волны приводит к высоким повреждениям клеток после дефростации.

Новый методологический подход к низкотемпературному консервированию репродуктивных клеток рыб с применением акустико-механического воздействия открывает большие возможности для создания новых эффективных методов глубокого замораживания.

Таким образом, акустико-механическое воздействие можно применять для улучшения репродуктивных качеств спермы осетровых рыб, однако полученные результаты можно считать предварительными, требуется дальнейшее проведение исследований по оценке оплодотворяющей способности клеток после дефростации.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работы выполнены с использованием Биоресурсной коллекции редких и исчезающих видов рыб ЮНЦ РАН № 73602 при финансовой поддержке гранта РНФ № 21-16-00118.