Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 371-376

Эпигенетический контроль экспрессии генов необходим для правильного развития и жизнедеятельности многоклеточных организмов. Важными эпигенетическими регуляторами транскрипции являются белки групп Polycomb (PcG) и Trithorax (TrxG), которые отвечают за репрессию и активацию транскрипции соответственно. Нарушения функционирования систем регуляции транскрипции белками PcG/TrxG связаны со многими патологическими состояниями, такими как онкологические заболевания, что делает необходимым понимание механизма их действия, в том числе принципов привлечения на хроматин [1–5].

У Drosophila белки PcG/TrxG взаимодействуют со специализированными ДНК-элементами PRE (Polycomb Response Elements), называемыми также сайленсерами [6–8]. В экспериментах с трансгенными конструкциями было показано, что отдельно взятый PRE-элемент может привлекать белки PcG/TrxG и вызывать репрессию репортерного гена. Однако функциональная активность PRE очень сильно зависит от геномного окружения, и репрессия наблюдается примерно в половине трансгенов, тогда как в остальных случаях PRE может либо быть в нейтральном статусе (не влиять на активность репортерного гена), либо активировать транскрипцию. При этом важно отметить, что белки PcG/TrxG могут привлекаться на ДНК-последовательность PRE вне зависимости от его статуса, однако может меняться уровень их ассоциации с хроматином [9]. Вопрос о том, каким образом контролируется активность PRE, в настоящее время является предметом активных научных исследований.

Ранее нами было показано, что вставка сайтов связывания для архитектурных белков (Su(Hw), CTCF либо Pita) рядом с PRE может усиливать или даже индуцировать PRE-зависимую репрессию гена-мишени [10]. При этом индукция репрессии сопряжена с привлечением белков PcG (Ph, Sfmbt), TrxG (Trx, CBP), а также двух PRE-ассоциированных ДНК-связывающих факторов – Pho и Combgap. В то же время остается не известным, связываются ли с ДНК-последовательностью PRE в неактивном состоянии другие ДНК-ассоциированные факторы. Потенциально возможны два варианта. В первом случае можно ожидать, что в отсутствие сайтов для архитектурных белков область PRE остается прочно ассоциирована с нуклеосомами и является недоступной для любых контактов с ДНК-связывающими белками. Во втором варианте с областью PRE может взаимодействовать ограниченное число транскрипционных факторов, но их недостаточно для привлечения полноценного комплекса PcG/TrxG белков.

В настоящей работе мы проверили ассоциацию с PRE двух ДНК-связывающих белков, GAF и Psq, в нейтральном статусе и при активации репрессии. Оба фактора связываются с (GA)_n-повторами (GAGA-сайтами), узнавая одни и те же мотивы в составе PRE и являются прямыми физическими партнерами, взаимодействуя друг с другом через BTB-домены [11]. Более того, для GAF было продемонстрировано, что он является пионерным транскрипционным фактором и, по крайней мере, на ряде геномных позиций может вызывать привлечение ремоделеров хроматина и способствовать связыванию различных функциональных комплексов с ДНК [11]. Таким образом, задачей данного исследования была проверка способности пионерного фактора GAF, а также его партнера Psq, взаимодействовать с неактивным bxdPRE в отсутствие расположенных рядом сайтов связывания для архитектурных белков.

Тестирование зависимости привлечения белков GAF и Psq от сайтов связывания архитектурных белков проводилось на разработанной ранее модельной системе [10]. Все используемые в данном исследовании трансгены были встроены в область генома 96E на третьей хромосоме с помощью системы сайт-специфической интеграции PhiC31 путем рекомбинации между сайтом attB, содержащимся в плазмиде, и сайтом attP, ранее встроенным в геном с помощью транспозона Mariner [12]. В качестве модельного PRE в данной работе во всех трансгенных конструкциях использовался хорошо охарактеризованный элемент bxdPRE длиной 656 п.н. из регуляторной области гена Ubx [9]. На рис. 1 а представлена последовательность bxdPRE и указаны сайты для PRE ДНК-связывающих белков: GAF/Psq – GAGAG [13, 14]; Pho – GCCAT [15, 16]; Zeste – YGAGYG (Y = C or T) [17, 18]; Sp1/Klf – RRGGYG (R = A or G) [19]; Comgbap (Cg) – GTGT [20].

Рис. 1.

(а) Предсказанные сайты связывания известных PRE-ассоциированных ДНК-связывающих белков сайленсера bxdPRE длиной 656 п.н. (б) Схематическое изображение трансгенов. Обозначения: “attB” – сайт attB, необходимый для интеграции трансгена; “bxdPRE” – сайленсер bxdPRE; “Т” – терминаторы транскрипции; white – репортерный ген; “Е” – энхансер гена white, “4xSu” – четыре сайта связывания белка Su(Hw). Числа над схемами трансгенов (1, 2 или 6, 3, 4, 5) обозначают области, амплифицированные с помощью количественной ПЦР (qPCR) в экспериментах X-ChIP. (в, г) Результаты экспериментов по иммунопреципитации хроматина, выделеного из голов взрослых мух, гомозиготных по трансгенам “bxd” и “Su-bxd”. Эксперименты проводились с использованием антител против белков GAF (в) и Psq (г), либо с неспецифическими IgG неиммунизированного животного (IgG). По оси ординат указан процент обогащения каждой области в иммунопреципитированном материале по отношению к исходной ДНК (Input), нормированный на эндогенный позитивный контроль – область рядом с 656 п.н. bxdPRE в геноме (bxdPRE-Genome). По оси абсцисс – области исследования с помощью qPCR в трансгене и отрицательный контроль (ras – кодирующая область гена Ras64B). Вертикальные линии указывают стандартные отклонения.

Базовый трансген, названный bxd (рис. 1 б), содержит следующие функциональные элементы: сайт attB, сайленсер bxdPRE, репортерный ген white и тканеспецифичный энхансер гена white (E). Кроме того, bxdPRE в трансгене окружен ДНК-спейсерами длиной примерно 1 т.п.н. каждый, полученными из кодирующих областей генов eGFP и RFP, а также терминаторами транскрипции (с 5'-стороны от bxdPRE встроен терминатор SV40 и с 3'-стороны от bxdPRE – терминатор гена yellow).

Второй трансген, названный Su-bxd (рис. 1 б), содержит все элементы трансгена bxd, но вплотную с 5'-стороны от bxdPRE, встроены 4 сайта связывания для архитектурного белка Su(Hw) (4xSu).

Ген white отвечает за пигментацию глаз мух и необходим для оценки репрессорной активности сайленсера bxdPRE. Тканеспецифичный энхансер используется для повышения уровня экспрессии гена white, что необходимо для работы с трансгенами, содержащими репрессорные элементы, эффективно подавляющие транскрипцию репортерных генов. Фенотип глаз трансгенных мух напрямую коррелирует с уровнем транскрипции гена white [9]. В случае отсутствия репрессии фенотип глаз трансгенных мух будет красным, в случае наличия репрессии – пигментация глаз будет снижена вплоть до белой окраски в зависимости от степени репрессии.

Ранее нами было показано, что в составе трансгена bxd элемент bxdPRE находится в нейтральном статусе – не репрессирует транскрипцию (фенотип глаз трансгенных мух в геми- и гомозиготе красный) и не привлекает белки групп PcG/TrxG и PRE-ассоциированные ДНК-связывающие факторы Pho и Combgap. В то же время в составе трансгена Su-bxd, при добавлении четырех сайтов связывания для архитектурного белка Su(Hw), bxdPRE эффективно репрессирует ген white (фенотип глаз трансгенных мух коричневый в гемизиготе и светло-желтый в гомозиготе). Репрессия сопровождается привлечением белков PcG/TrxG, в том числе двух PRE-ассоциированных ДНК-связывающих белков Pho и Combgap. Кроме того, экспериментально было подтверждено, что в конструкции Su-bxd происходит привлечение Su(Hw) на 4xSu сайты [10].

В данной работе с помощью иммунопреципитации хроматина (X-ChIP), выделенного из голов гомозиготных трансгенных мух, мы проверили ассоциацию белков GAF и Psq с bxdPRE в трансгенах bxd и Su-bxd на взрослой стадии развития. Мы оценивали обогащение исследуемых белков на пяти областях трансгенов: (1) дистальный конец спейсерной последовательности перед bxdPRE, (2) bxdPRE, (3) дистальный конец последовательности спейсера после bxdPRE, (4) кодирующая область гена white и (5) промотор гена white (рис. 1 б). В качестве отрицательного внутреннего контроля был использован участок кодирующей области гена Ras64B (ras), в качестве положительного внутреннего контроля была выбрана область bxdPRE-Genome – область, связывающая белки GAF/Psq рядом с bxdPRE в геноме, но не входящая в состав bxdPRE в трансгенах. Проведенный анализ показал, что белок GAF, также как и белок Psq, не взаимодействует с неактивным bxdPRE в составе трансгена bxd (рис. 1 в). В то же время данные белки эффективно привлекаются на сайленсер bxdPRE в статусе репрессии в составе трансгена Su-bxd в присутствии сайтов связывания для архитектурного белка Su(Hw).

На следующем этапе мы изучили взаимодействие белков GAF и Psq с сайленсером bxdPRE при его индукции альтернативными архитектурными белками – CTCF или Pita. Для этого рядом с bxdPRE были встроены либо 4 сайта связывания архитектурного белка CTCF (трансген CTCF-bxd, рис. 2 a), либо 5 сайтов связывания архитектурного белка Pita (трансген Pita-bxd, рис. 2 a). В предыдущем исследовании мы показали, что сайты связывания данных архитектурных белков функционально ведут себя также, как и сайты связывания для белка Su(Hw) – в их присутствии активируется репрессорная активность bxdPRE. Как и в случае трансгена Su-bxd, обогащение белков GAF и Psq проверялось с помощью X-ChIP на пяти аналогичных областях трансгенов CTCF-bxd и Pita-bxd. Как и ранее, хроматин для иммунопреципитации был выделен из голов гомозиготных по конструкции мух на взрослой стадии развития. В качестве контроля все эксперименты проводились параллельно с выделением и иммунопреципитацией хроматина, выделенного из мух, несущих трансген bxd. В результате анализа нами было показано, что белки GAF и Psq привлекаются на элемент bxdPRE только в статусе репрессии в присутствии сайтов связывания для архитектурных белков CTCF или Pita (рис. 2 б, д).

Рис. 2.

(а) Схематическое изображение трансгенов. Обозначения: “4xCTCF” – четыре сайта связывания белка CTCF, “5xPita” – пять сайтов связывания белка Pita. (б, в) Результаты экспериментов по иммунопреципитации хроматина, выделеного из голов взрослых мух, гомозиготных по трансгенам “bxd” и “CTCF-bxd”. Были использованы специфические антитела к белкам GAF (Б), Psq (В). (г, д) Результаты экспериментов по иммунопреципитации хроматина, выделеного из голов взрослых мух, гомозиготных по трансгенам “bxd” или “Pita-bxd”. Были использованы специфические антитела к белкам GAF (Г), Psq (Д). Остальные обозначения как на рис. 1.

Таким образом, мы показали, что в используемой модельной системе пионерный фактор GAF, также как и белок Psq, не взаимодействует с неактивным bxdPRE. При этом активация опосредованной bxdPRE репрессии маркерного гена при добавлении сайтов связывания для архитектурных белков сопровождается привлечением GAF и Psq. Полученные данные показывают, что, по крайней мере в некоторых ситуациях, GAGA-сайтов недостаточно для привлечения GAGA-ассоциированных белков и, как следствие, взаимодействующих с ними транскрипционных комплексов на хроматин. Интересно, что использование сайтов связывания для всех трех протестированных архитектурных факторов приводит к примерно одинаковому усилению связывания GAF и Psq с bxdPRE. Несмотря на то что на сегодня известно около десяти PRE-ассоциированных ДНК-связывающих факторов [7, 8], вопрос о детальном механизме привлечения белков PcG/TrxG на хроматин остается открытым. Результаты данного исследования показывают, что в этих процессах важную роль могут играть не только ранее известные PcG/TrxG-ассоциированные ДНК-связывающие белки, но и различные архитектурные факторы, определяющие трехмерную структуру хроматина в ядре.