1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 506, № 1, 2022

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 366-370

ИНДУКЦИЯ ГИПОКСИЧЕСКОГО ОТВЕТА В КЛЕТКАХ CACO-2 ПРИВОДИТ К УВЕЛИЧЕНИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В ЭНДОЦИТОЗ И ТРАНСЦИТОЗ SARS-COV-2

С. А. Нерсисян 1, 2, *

1 Факультет биологии и биотехнологии, Национальный исследовательский университет “Высшая школа экономики”
Москва, Российская Федерация

2 Институт молекулярной биологии Национальной академии наук Республики Армения
Ереван, Армения

* E-mail: snersisyan@hse.ru

Поступила в редакцию 08.06.2022
После доработки 28.06.2022
Принята к публикации 28.06.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

В настоящей работе оценивали влияние гипоксического ответа в клетках Caco-2 на экспрессию генов и микроРНК, вовлеченных в механизмы внутриклеточного транспорта вирусных частиц SARS-CoV-2, а именно, эндоцитоз и трансцитоз. С помощью секвенирования РНК показано, что при имитации гипоксии путем воздействия на клетки производного оксихинолина двукратно увеличивается экспрессия канонического рецептора ACE2 для вируса SARS-CoV-2, а также экспрессия неканонического рецептора TFRC. Значимый рост экспрессии наблюдался для генов из семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDL), играющих ключевую роль в трансцитозе: LDLR, LRP1, LRP4 и LRP5. Повышение уровней экспрессии LDLR сопровождалось понижением экспрессии микроРНК hsa-miR-148a-3p, способной напрямую связываться с мРНК LDLR. Таким образом, в ходе гипоксического ответа в клетках Caco-2 повышается экспрессия генов, вовлеченных в механизмы эндоцитоза и трансцитоза вирусных частиц SARS-CoV-2.

Ключевые слова: Caco-2, кишечник, гипоксия, оксихинолин, SARS-CoV-2, ACE2, LDL, транскриптом, микроРНК

Список сокращений: ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени. GO – gene ontology. FDR – false discovery rate, уровень ложноположительных результатов. FPKM – fragments per kilobase of transcript per million mapped. HIF – hypoxia-inducible factor, индуцируемый гипоксией фактор. KEGG – Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. RPM – reads per million mapped reads.

Активная репликация вируса SARS-CoV-2 в кишечнике может являться причиной возникновения симптомов со стороны желудочно-кишечного тракта у пациентов с COVID-19 [1]. Известно, что в кишечнике значительной доли переболевших COVID-19 сохраняется вирусная РНК в промежутке от недели до нескольких месяцев. Более того, длительное присутствие вирусной РНК коррелирует с нарушениями пищеварения, что может являться одним из факторов постковидного синдрома [2, 3]. Гипоксия является одним из основных индукторов патологий кишечника, включая воспаление и колоректальный рак [4]. Роль гипоксии во взаимодействиях SARS-CoV-2 и клеток кишечника на сегодняшний день не установлена.

Главными “входными воротами” в клетку для вирусной частицы SARS-CoV-2 является рецептор ACE2, экспрессирующийся на поверхности эпителиальных клеток многих органов, включая легкие и кишечник [5]. Дальнейшая судьба вируса может включать в себя трансцитоз, позволяющий вирусу пересекать кишечный барьер, что может иметь важное клиническое значение. Ранее было установлено, что одной из наиболее подходящих клеточных моделей для изучения эндоцитоза и трансцитоза вирусных частиц SARS-CoV-2 являются клеточные линии Caco-2, экспрессирующие все необходимые факторы [6].

МикроРНК – класс коротких некодирующих РНК, осуществляющих негативную регуляцию экспрессии генов. Связывание seed региона микроРНК (нуклеотиды 2–7 с 5'-конца молекулы) с 3'-нетранслируемой областью (3'-НТО) мРНК-мишени приводит к деградации мРНК или к остановке трансляции [7, 8]. Нами ранее было показано, что семейство микроРНК miR-200 подавляет экспрессию ACE2 [9]. Поиск регуляторных механизмов для других генов, вовлеченных во взаимодействия SARS-CoV-2 и клеток, представляет большой интерес.

В настоящей работе с помощью секвенирования нового поколения был проанализирован профиль экспрессии генов и микроРНК дифференцированных клеток Caco-2 под воздействием производного оксихинолина, являющейся ингибитором HIF-пролилгидроксилазы и имитирующей гипоксию путем стабилизации HIF1A – главного транскрипционного фактора, индуцируемого гипоксией [10].

Эксперименты проводили аналогично исследованию [11]. Вкратце, клетки Caco-2 получали из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия) и инкубировали 21 день в условиях для дифференцировки. Воздействие на клетки производили с помощью производного оксихинолина 4896–3212 (Исследовательский Институт Химического Разнообразия, Химки, Россия): 7-((4-(трет-бутил)фенил)((4-метилпиридин-2-ил)амино)метил)хинолин-8-ол (см. детали в [12]), концентрация – 5 мкМ. После 24-часовой инкубации клетки лизировали для дальнейшего анализа. В каждой группе (воздействие и контроль) использовали по три биологических повтора. РНК выделяли с помощью Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Приготовление библиотек для секвенирования мРНК и микроРНК проводили с помощью наборов Illumina Stranded mRNA Library Prep Kit и NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Illumina, Сан-Диего, США) соответственно. Использовали секвенатор Illumina NextSeq 550.

Качество исходных FASTQ файлов секвенирования оценивали с помощью FastQC версии 0.11.9 (Babraham Bioinformatics, Кембридж, Англия), адаптеры прочтений обрезали с помощью cutadapt версии 2.10. Ненормированные таблицы экспрессий мРНК и микроРНК получали путем картирования прочтений секвенирования с помощью STAR версии 2.7.5b и miRDeep2 версии 2.0.1.2 соответственно. Полученные таблицы нормировали и фильтровали с использованием edgeR версии 3.30.3, получая на выходе логарифмированные по основанию 2 шкалы fragments per kilobase of transcript per million mapped reads (FPKM) и reads per million mapped reads (RPM) для мРНК и микроРНК секвенирований соответственно. Анализ дифференциальной экспрессии мРНК и микроРНК проводили с помощью DESeq2 версии 1.28.1. Значимыми считали изменения экспрессии с кратностью изменения не менее 1.5 и False Discovery Rate (FDR) <0.05 (для расчетов FDR использовали процедуру Бенджамини-Хохберга).

Валидацию изменений экспрессии ключевых мРНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с обратной транскрипцией аналогично исследованию [13]. Последовательности использованных праймеров приведены в табл. 1. Анализ дифференциальной экспрессии по данным ПЦР-РВ проводили с помощью метода ΔΔCt и t-критерия Стьюдента, в качестве референсного гена использовали ACTB.

Таблица 1.

Использованные для ПЦР-РВ праймеры и их эффективность

Ген Прямой праймер Обратный праймер Эффективность
ACE2 AGAGAAGTGGAGGTGGATGGTCTTT GCGGGGTCACAGTATGTTTCATCA 2.10
TFRC GTCCAGACAATCTCCAGAGCTGC TCTGTTTTCCAGTCAGAGGGACAGT 1.97
LDLR CATTGTCCTCCCCATCGTGCTC AGCTGTAGCCGTCCTGGTTG 2.06
LRP1 GGCGTCACTTGCTTGGCGAA TGAATCGGTCCGAGGGGCAG 2.08
LRP4 GGGAGTGTGAGGAGGACGAGT TGGCACTGCTGAGGGACAGTTC 1.98
LRP5 TGCGATGACCAGAGCGACGA GCAGGCAGATGGCGTCACAG 1.97
ACTB CTGGAACGGTGAAGGTGACA AAGGGACTTCCTGTAACAACGCA 2.03

Гены, вовлеченные в процессы эндоцитоза и трансцитоза, выделяли из базы данных Gene Ontology (GO). Анализ обогащения по функциональной принадлежности проводили с помощью веб-сервиса DAVID версии 2021 г., используя базу данных биологических путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Мишени микроРНК предсказывали с помощью веб-портала miRDB версии 6.0.

В результате сравнения профилей экспрессии мРНК между образцами с индуцированной гипоксией и контрольными клетками было найдено 6309 дифференциально экспрессированных генов. Анализ обогащения дифференциально экспрессированных генов по функциональной принадлежности выявил отчетливую активацию сигнального пути HIF1A (KEGG hsa04066, FDR <0.05) и анаэробного гликолиза (KEGG hsa00010, FDR <0.05), что является свидетельством индукции гипоксического ответа при обработке клеток Caco-2 оксихинолином. Тот же анализ не выявил активацию путей, связанных с возможной токсичностью воздействия на клетки (в частности, апоптоз и репарация ДНК). Наблюдалось двукратное увеличение экспрессии гена ACE2 (FDR <0.05), кодирующего основной рецептор для вируса SARS-CoV-2 (рис. 1). Помимо канонического рецептора было отмечено двукратное увеличение экспрессии мРНК рецептора трансферрина 1 TFRC, также способного к связыванию S-белка SARS-CoV-2 с последующим эндоцитозом вирусной частицы [14].

Рис. 1.

Кратность изменения экспрессии генов ACE2, TFRC, LDLR, LRP1, LRP4, LRP5 при гипоксическом ответе в клетках Caco-2. Высота вертикальных отрезков обозначает стандартное отклонение, рассчитанное по трем экспериментальным и трем контрольным образцам с помощью DESeq2 (FDR <0.05 для всех генов).

При анализе дифференциально экспрессированных генов, кодирующих белки, вовлеченные в эндоцитоз и трансцитоз, было отмечено статистически значимое повышение уровня экспрессии генов семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDL), включая LDLR (кратность изменения 3.0), LRP1 (кратность изменения 1.6), LRP4 (кратность изменения 3.7), LRP5 (кратность изменения 1.5), см. рис. 1. Одной из хорошо изученных функций данных рецепторов является трансцитоз LDL через различные барьеры [15, 16]. Ранее было показано, что повышенная экспрессия рецептора LDLR является фактором тяжелого течения у пациентов с COVID-19 [17, 18]. Изменение экспрессии генов ACE2, TFRC, LDLR, LRP1, LRP4, LRP5 было подтверждено с помощью ПЦР-РВ: статистически значимый рост уровней экспрессии (p <0.05) наблюдался для всех генов, кратности изменения экспрессии, согласно ПЦР-РВ, были в 1–1.7 раза выше, чем по данным секвенирования РНК.

Для поиска возможных причин изменения экспрессии генов при гипоксическом ответе был проведен анализ дифференциально экспрессированных микроРНК, уровни экспрессии которых оценивали с помощью секвенирования. Двумя высокоэкспрессированными микроРНК со значимым (FDR <0.05) различием экспрессии в обработанных оксихинолином и контрольных клетках были hsa-miR-210-3p и hsa-miR-148a-3p. Экспрессия hsa-miR-210-3p возросла в 1.7 раза при воздействии оксихинолином, что является еще одним свидетельством успешной индукции гипоксического ответа – повышенная экспрессия hsa-miR-210-3p является общепринятым маркером клеточного ответа на гипоксию [19].

Следующая микроРНК, hsa-miR-148a-3p, являлась четвертой по абсолютному уровню экспрессии среди всех микроРНК контрольных клеток Caco-2, занимая 7% от всех прочтений секвенирования. Снижение уровня экспрессии микроРНК hsa-miR-148a-3p в полтора раза при воздействии оксихинолином являлось возможной причиной роста экспрессии гена LDLR. А именно, 3′-нетранслируемая область мРНК LDLR содержала два сайта связывания seed регионов микроРНК hsa-miR-148a-3p типов 7mer-m8 (комплементарность нуклеотидов 2–8 с 5'-конца микроРНК) и 8mer (7mer-m8, а также напротив 1-го нуклеотида с 5'-конца микроРНК расположен аденин), см. рис. 2. Взаимодействие hsa-miR-148a-3p и LDLR  было ранее подтверждено с помощью люциферазных репортерных конструкций [20].

Рис. 2.

Сайты связывания hsa-miR-148a-3p в 3'-нетранслируемой области мРНК LDLR. Жирным шрифтом выделены расширенные seed регионы микроРНК и соответствующие им участки мРНК-мишени.

Таким образом, было показано, что при моделировании гипоксии производного оксихинолина в клетках Caco-2 повышается экспрессия генов ACE2 и TFRC, кодирующих рецепторы, способные к связыванию с S-белком вируса SARS-CoV-2, а также повышение уровня экспрессии генов семейства рецепторов LDL, вовлеченных в механизмы эндоцитоза и трансцитоза. Одной из причин роста экспрессии гена LDLR могло служить снижение уровня экспрессии микроРНК hsa-miR-148a-3p, способной напрямую связываться с мРНК LDLR. Следовательно, гипоксия кишечника может являться неблагоприятным фактором при COVID-19.

Список литературы

  1. Qian Q., Fan L., Liu W., Li J., Yue J., Wang M., Ke X., Yin Y., Chen Q., Jiang C. Direct Evidence of Active SARS-CoV-2 Replication in the Intestine. // Clinical Infectious Diseases. 2021. V. 73. P. 361–366.

  2. Natarajan A., Zlitni S., Brooks E.F., Vance S.E., Dahlen A., Hedlin H., Park R.M., Han A., Schmidtke D.T., Verma R., Jacobson K.B., Parsonnet J., H.F. Bonilla, Singh U., Pinsky B.A., Andrews J.R., Jagannathan P., Bhatt A.S. Gastrointestinal symptoms and fecal shedding of SARS-CoV-2 RNA suggest prolonged gastrointestinal infection. // Med (New York, N.Y.) 2022.

  3. Zollner A., Koch R., Jukic A., Pfister A., Meyer M., Rössler A., Kimpel J., Adolph T.E., Tilg H., Postacute COVID-19 is Characterized by Gut Viral Antigen Persistence in Inflammatory Bowel Diseases. // Gastroenterology. (2022).

  4. Singhal R., Shah Y.M., Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. // The Journal of Biological Chemistry. 2020. V. 295. P. 10493–10505.

  5. Sungnak W., Huang N., Bécavin C., Berg M., Queen R., Litvinukova M., Talavera-López C., Maatz H., Reichart D., Sampaziotis F., Worlock K.B., Yoshida M., Barnes J.L. HCA Lung Biological Network, SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. // Nature Medicine. 2020. V. 26. P. 681–687.

  6. Knyazev E., Nersisyan S., Tonevitsky A. Endocytosis and Transcytosis of SARS-CoV-2 Across the Intestinal Epithelium and Other Tissue Barriers. // Frontiers in Immunology. 2021. V. 12. P. 636966.

  7. Nersisyan S., Shkurnikov M., Poloznikov A., Turchinovich A., Burwinkel B., Anisimov N., Tonevitsky A. A Post-Processing Algorithm for miRNA Microarray Data. // International Journal of Molecular Sciences. 2020. V. 21.

  8. Turchinovich A., Tonevitsky A.G., Cho W.C., Burwinkel B. Check and mate to exosomal extracellular miRNA: new lesson from a new approach. // Frontiers in Molecular Biosciences. 2015. V. 2. P. 11.

  9. Nersisyan S., Shkurnikov M., Turchinovich A., Knyazev E., Tonevitsky A. Integrative analysis of miRNA and mRNA sequencing data reveals potential regulatory mechanisms of ACE2 and TMPRSS2. // PloS One. 2020. V. 15. P. e0235987.

  10. Poloznikov A.A., Nersisyan S.A., Hushpulian D.M., Kazakov E.H., Tonevitsky A.G., Kazakov S.V., Vechorko V.I., Nikulin S.V., Makarova J.A., Gazaryan I.G. HIF Prolyl Hydroxylase Inhibitors for COVID-19 Treatment: Pros and Cons. // Frontiers in Pharmacology. 2020. V. 11. P. 621054.

  11. Nersisyan S., Galatenko A., Chekova M., Tonevitsky A. Hypoxia-Induced miR-148a Downregulation Contributes to Poor Survival in Colorectal Cancer. // Frontiers in Genetics. 2021. V. 12. P. 662468.

  12. Savyuk M., Krivonosov M., Mishchenko T., Gazaryan I., Ivanchenko M., Khristichenko A., Poloznikov A., Hushpulian D., Nikulin S., Tonevitsky E., Abuzarova G., Mitroshina E., Vedunova M. Neuroprotective Effect of HIF Prolyl Hydroxylase Inhibition in an In Vitro Hypoxia Model. // Antioxidants (Basel, Switzerland). 2020. V. 9. P. 662.

  13. Maltseva D., Raygorodskaya M., Knyazev E., Zgoda V., Tikhonova O., Zaidi S., Nikulin S., Baranova A., Turchinovich A., Rodin S., Tonevitsky A. Knockdown of the α5 laminin chain affects differentiation of colorectal cancer cells and their sensitivity to chemotherapy.// Biochimie. 2020. V. 174. P. 107–116.

  14. Tang X., Yang M., Duan Z., Liao Z., Liu L., Cheng R., Fang M., Wang G., Liu H., Xu J., Kamau P.M., Zhang Z., Yang L., Zhao X., Peng X., Lai R. Transferrin receptor is another receptor for SARS-CoV-2 entry. // BioRxiv. 2020 2020.10.23.350348.

  15. Dehouck B., Fenart L., Dehouck M.P., Pierce A., Torpier G., Cecchelli R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. // The Journal of Cell Biology. 1997. V. 138. P. 877–889.

  16. Zhang X., Sessa W.C., Fernández-Hernando C. Endothelial Transcytosis of Lipoproteins in Atherosclerosis. // Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2018. V. 5. P. 130.

  17. Vlasov I., Panteleeva A., Usenko T., Nikolaev M., Izumchenko A., Gavrilova E., Shlyk I., Miroshnikova V., Shadrina M., Polushin Y., Pchelina S., Slonimsky P. Transcriptomic Profiles Reveal Downregulation of Low-Density Lipoprotein Particle Receptor Pathway Activity in Patients Surviving Severe COVID-19. // Cells. 2021. V. 10.

  18. Cure E., Cumhur M. Cure. Strong relationship between cholesterol, low-density lipoprotein receptor, Na+/H+ exchanger, and SARS-COV-2: this association may be the cause of death in the patient with COVID-19. // Lipids in Health and Disease. 2021. V. 20. P. 179.

  19. Huang X., Le Q.-T., Giaccia A.J. MiR-210–micromanager of the hypoxia pathway. // Trends in Molecular Medicine. 2010. V. 16. 230–237.

  20. Goedeke L., Rotllan N., Canfrán-Duque A., Aranda J.F., Ramírez C.M., Araldi E., Lin C.-S., Anderson N.N., Wagschal A., de Cabo R., Horton, J.D. Lasunción M.A., Näär A.M., Suárez Y., Fernández-Hernando C. MicroRNA-148a regulates LDL receptor and ABCA1 expression to control circulating lipoprotein levels. // Nature Medicine. 2015. V. 21. P. 1280–1289.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал