Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 354-360

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на важнейшую роль хлоропластов в жизни растений, молекулярные механизмы их биогенеза остаются мало изученными. Формирование хлоропластов обычно происходит либо из пропластид в меристематических тканях, либо из этиопластов в процессе деэтиоляции растений.

Главным экзогенным фактором, определяющим биогенез фотосинтетически активных хлоропластов из этиопластов, является свет [1]. Свет разного качества воспринимается той или иной группой рецепторов, в большей степени, в цитоплазме, после чего сигнал поступает в ядро, что приводит к масштабному изменению экспрессии ядерных генов растительной клетки, многие из которых кодируют структурные и регуляторные белки хлоропластов. Контроль биогенеза фотосинтетически активных пластид белками ядерного кодирования называется антероградной регуляцией, которая играет, вероятно, ведущую роль на всех этапах биогенеза хлоропластов.

Одним из наиболее ярких примеров антероградного контроля формирования хлоропластов является перепрограммирование экспрессии пластидных генов вследствие свето- и гормон-зависимого изменения активности аппарата транскрипции пластид в ходе деэтиоляции. В этиопластах транскрипцию, главным образом, осуществляют РНК-полимеразы типа NEP (Nuclear-Encoded RNA Polymerase) ядерного кодирования RPOTp и, в меньшей степени, RPOTmp, которые транскрибируют в значительной мере гены “домашнего хозяйства”. Вторая мультисубъединичная РНК-полимераза РЕР (Plastid-Encoded RNA Polymerase) состоит из коровых субъединиц α, β, β' и β" пластидного кодирования и проявляет слабую транскрипционную активность в нефотосинтезирующих пластидах. В ходе деэтиоляции РЕР-полимераза претерпевает значительные структурные изменения за счет формирования комплекса с одним из сигма-факторов (SIG1-SIG6) и белками ядерного кодирования, ассоциированными с PEP (PAP1-PAP12), после чего РЕР-полимераза инициирует транскрипцию фотосинтетических генов пластома [2]. Таким образом, ядерный геном контролирует транскрипционную активность пластидного генома путем координации транскрипции генов РНК-полимераз RPOTp и RPOTmp, сигма-факторов и PAP белков.

Ключевыми регуляторами экспрессии ядерного генома являются светозависимые факторы транскрипции. У A. thaliana были идентифицированы два транс-фактора GLK1 и GLK2 (Golden two-LiKe), инактивация которых приводит к нарушениям биогенеза хлоропластов [3] вследствие снижения транскрипции ядерных генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла, белки фотосинтетических комплексов и тилакоидных мембран [4].

Помимо света, программа деэтиоляции определяется факторами эндогенной природы – фитогормонами, среди которых цитокинины (ЦК) способны ускорять формирование хлоропластов [5]. Убедительно показано, что ЦК позитивно регулируют экспрессию генов ферментов биосинтеза хлорофилла и белков аппарата транскрипции пластома, стимулируют накопление фотосинтетических пигментов и ускоряют формирование ультраструктуры хлоропластов [6, 7]. В ряде тестов в действии света и ЦК наблюдается синергический эффект, что допускает возможность пересечения путей передачи сигнала света и цитокининов [6–8]. К настоящему времени показано, что одной из “точек пересечения” является светозависимый транс-фактор HY5, инактивация которого приводит к уменьшению позитивного действия ЦК в ходе деэтиоляции [8]. Однако отсутствие HY5 не исключает эффект ЦК, что позволяет предположить участие и других светозависимых транс-факторов, опосредующих действие ЦК в ходе деэтиоляции [9].

Как уже упоминалось, у A. thaliana инактивация генов двух транс-факторов GLK1 и GLK2 приводит к нарушению транскрипции как ядерных, так и пластидных фотосинтетических генов [3, 4]. Кроме того, Kobayashi и соавт. [10] показали, что белки GLKs участвуют в реализации позитивного эффекта ЦК на накопление хлорофилла в ходе деэтиоляции корней, а экспрессия гена GLK2 активируется гормоном. Эти результаты наводят на мысль о возможном участии GLKs в регуляции экспрессии ядерных генов аппарата транскрипции пластид светом и ЦК. В данной работе мы впервые продемонстрировали вовлечение транс-факторов GLKs в цитокинин-зависимую регуляцию экспрессии ядерного гена SCA3, кодирующего пластидную РНК-полимеразу, что приводит к изменению экспрессии пластидных генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили растения дикого типа Arabidiopsis thaliana экотипа Columbia-0 и созданного на его основе нокаут-мутанта по генам транс-факторов glk1glk2 (N9807, NASC, Великобритания). Наличие инсерции dSpm в генах GLK1 и GLK2 [3] доказано методом ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих вставку на ген GKL1: Spm5 (F) 5'-ggatccgacactctttaattaactgacact-3'; (R) 5'-acttcttcacctttccccgaacta-3'; на ген GLK2: Spm1 (F) 5'- cctatttcagtaagagtgtggggttttgg-3'; (R) 5'-aacaatctttacttttcttccctttacg-3'. ПЦР-анализ с ДНК нокаут-мутанта glk1glk2 подтвердил наличие вставок dSpm в генах GLK1 и GLK2. Амплификация с ДНК из растений дикого типа показала отсутствие конструкций dSpm в растениях материнской линии A. thaliana. Таким образом, подтверждена гомозиготность нокаут-линий glk1glk2 A. thaliana, полученных из банка семян NASC.

Для изучения участия транс-факторов GLK1 (AT2G20570) и/или GLK2 (AT5G44190) в цитокинин-зависимой регуляции экспрессии гена SCA3 в ходе деэтиоляции применяли экспериментальную постановку, разработанную Chory и соавт. [11]. Семена A. thaliana дикого типа и нокаут-мутанта glk1glk2 стерилизовали раствором гипохлорита натрия и высевали на чашки Петри с питательной средой Мурасиге-Скуга, содержавшей ½ питательных элементов (“Duchefa”, Нидерланды) без сахарозы и цитокинина или с добавлением транс-зеатина (1 мкМ). Семена стратифицировали в течение 4 дней при +4°С, после чего чашки Петри переносили на +22°С в условия полной темноты. По истечении 4 сут с момента прорастания растения фиксировали в жидком азоте при слабом зеленом освещении (5 ± ± 2 µmol s^–1 m^–2). Оставшуюся часть проростков переносили на белый свет с интенсивностью 120 µmol s^–1 m^–2 в климатическую камеру MLR-352Н-PE (Sanyo, Япония) и фиксировали в жидком азоте спустя 6 и 16 ч.

Относительный уровень транскриптов оценивали методом ПЦР в режиме реального времени после обратной транскрипции (ПЦР-РВ) с использованием амплифкатора LigthCyclerR96 (“Roche”, Швейцария). Количество транскриптов целевых генов нормировали относительно содержания мРНК референсного гена полиубиквитина UBQ10 (AT4G05320). Для ПЦР-РВ анализа использовали следующие пары праймеров: ARR5 – (F) ctactcgcagctaaaacgc; (R) gccgaaagaatcaggaca; GLK1 – (F) tcggactaaaaatggatggcttg; (R) ggtagaaggcggaggtaagtgtttg; GLK2 – (F) gccaaaacacaagcctaatactccg; (R) tgtggatagagtggttgctgatgc; SCA3 – (F) ttgctgctgcttgctattctgc; (R) gcacaatcaccaagccaact; accD – (F) gctaccaatcaatgtttacctc; (R) gattgataatcacataaaaccg; clpP – (F) cattccagatattacccatcca; (R) gccaagaggttgataccgaa; UBQ10 – (F) gcgtcttcgtggtggttctaa; (R) gaaagagataacaggaacggaaaca. Образцы анализировали в трех биологических повторностях, каждая из которых включала по 3–4 аналитических повтора. Статистическая обработка проводилась  согласно критерию Стьюдента (t-test) (*–p < 0.05, **–p < 0.01).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние цитокинина на морфологию проростков дикого типа и нокаут-мутанта glk1glk2 A. thaliana. Семейство белков GLKs включает два транскрипционных фактора – GLK1 и GLK2, функции которых в значительной степени перекрываются. Нокаут-мутанты первого порядка имеют слабые фенотипические отличия от растений дикого типа, в то время как двойной мутант glk1glk2, который мы используем в данной работе, отличается от материнской линии меньшим размером розетки и пониженным содержанием хлорофилла (рис. 1а) [3].

Рис. 1.

Морфология растений дикого типа и нокаут-мутанта glk1glk2 A. thaliana. а – 3-недельные растения, слева – дикого типа (ДТ), справа – нокаут-мутанта glk1glk2; б – 4-дневные этиолированные проростки дикого типа и glk1glk2, выращенные на питательной среде без гормона (0 мкМ транс-зеатина) или в присутствии ЦК (1 мкМ транс-зеатин) спустя 16 ч освещения.

Одним из характерных эффектов ЦК является укорочение гипокотиля проростка в темноте [11]. В условиях нашего эксперимента проростки дикого типа и двойного нокаут-мутанта glk1glk2, выращенные на питательной среде без ЦК, фенотипически не отличались (рис. 1б). Добавление в среду для выращивания транс-зеатина (1 мкМ) приводило к подавлению роста гипокотиля у растений дикого типа на 46% (без цитокинина 12.6 ± ± 1.5 мм, с транс-зеатином – 6.88 ± 1.6 мм). Растения нокаут-мутанта glk1glk2 в присутствии ЦК имели длину гипокотиля на 38% короче, чем проростки, выращенные без гормона (без ЦК – 12.9 ± 1.4 мм, с транс-зеатином – 8.11 ± 1.45 мм). Этот результат подтверждает эффективность действия ЦК в условиях нашего эксперимента, а также указывает на чувствительность мутанта к экзогенному гормону.

Мутации по генам транс-факторов GLKs (glk1glk2) не нарушают чувствительность растений к цитокинину. Для подтверждения чувствительности нокаут-мутанта glk1glk2 к экзогенному ЦК мы изучили динамику содержания транскриптов гена семейства регуляторов ответа на цитокинин типа-А ARR5. Характерной особенностью данного семейства генов является их быстрая индукция в ответ на ЦК [12].

Результаты ПЦР в режиме реального времени показали увеличение уровня транскриптов гена ARR5 в проростках дикого типа и нокаут-мутанта glk1glk2 как в условиях темноты, так и в ходе цитокинин-зависимой деэтиоляции (рис. 2). При этом динамика содержания транскриптов исследуемого гена в проростках дикого типа и мутанта glk1glk2 была сходной.

Рис. 2.

Влияние цитокинина на содержание транскриптов гена ARR5 в проростках дикого типа и нокаут-мутанта glk1glk2 A. thaliana в темноте и в ходе деэтиоляции. ** – достоверные различия между средними значениями экспрессии в проростках, выращенных на питательной среде без цитокинина vs. экспрессии в растениях, обработанных транс-зеатином при p ≤ 0.01.

Эти результаты позволяют заключить, что мутации по генам транс-факторов GLKs не влияют на восприятие и, возможно, передачу цитокининового сигнала и, что мутант glk1glk2 чувствителен к экзогенному гормону подобно дикому типу.

Цитокинин регулирует экспрессию генов транс-факторов GLK1 и GLK2 в ходе деэтиоляции. Ранее Kobayashi и соавт. [10] в экспериментах по зеленению корней A. thaliana продемонстрировали цитокинин-зависимую индукцию гена GLK2. Избирательность анализа экспрессии только GLK2 была основана на тканеспецифичности экспрессии генов семейства GLKs: для GLK1 характерна экспрессия только в фотосинтетических тканях, в корнях же уровень транскрипции GLK1 ниже уровня детекции, а экспрессия GLK2 характерна как для зеленых, так и для нефотосинтезирующих тканей (корней) [3]. Однако остается неизвестным, индуцирует ли ЦК экспрессию гена GLK1 и сохраняется ли цитокинин-зависимая регуляция гена GLK2 в ходе деэтиоляции проростков A. thaliana. Располагая данными о том, что оба гена семейства GLKs экспрессируются в семядольных листьях [3], мы предположили, что GLKs могут являться участниками цитокинин-зависимого регуляторного каскада экспрессии генов в ходе деэтиоляции.

Анализ содержания транскриптов генов GLK1 и GLK2 в проростках дикого типа A. thaliana показал светозависимое накопление матриц исследуемых генов (рис. 3). Такая индукция содержания транскриптов генов GLKs согласуется с данными Fitter и соавт. [3].

Рис. 3.

Регуляция светом и цитокинином содержания транскриптов генов GLK1 и GLK2 в 4-дневных проростках дикого типа A. thaliana в ходе деэтиоляции. ** – достоверные различия между средними значениями экспрессии в проростках, выращенных на питательной среде без цитокинина vs. экспрессии в растениях, обработанных транс-зеатином при p ≤ 0.01.

На фоне действия света ЦК увеличивал содержание транскриптов генов GLK1 и GLK2 как в условиях темноты, так и спустя 6 ч (GLK2) или 16 ч (GLK1) деэтиоляции (рис. 3). Этот результат позволяет предположить, что транс-факторы GLK1 и GLK2 могут принимать участие в цитокинин-зависимой регуляции экспрессии генов в ходе зеленения проростков A. thaliana.

Транс-факторы GLKs регулируют цитокинин-зависимую экспрессию гена SCA3, кодирующего пластидyю РНК-полимеразу RPOTp.

Для того чтобы установить, участвуют ли белки семейства GLKs в регуляции экспрессии гена SCA3 и RPOTp-зависимых пластидных генов, использовали двойной мутант glk1glk2.

Цинокинин-зависимая активация экспрессии генов транс-факторов GLKs позволила нам предположить участие данных факторов транскрипции в ЦК-зависимой активации экспрессии гена РНК-полимеразы SCA3. Ранее нами была продемонстрирована регуляция цитокинином уровня транскриптов гена SCA3 в ходе зеленения A. thaliana [7], однако участники молекулярного каскада реализации данного позитивного эффекта до сих пор неизвестны.

Как показывают полученные результаты (рис. 4а), освещение этиолированных растений стимулировало увеличение уровня транскриптов гена SCA3 как в проростках дикого типа, так и нокаут-мутанта glk1glk2, при этом отсутствие транс-факторов GLKs не изменяло ни профиль, ни уровень транскриптов в растениях glk1glk2 (рис. 4а). В свою очередь, в отличие от дикого типа, обработка транс-зеатином проростков glk1glk2 не приводила к увеличению содержания матриц гена SCA3. Отсутствие реакции на ЦК указывает на возможное участие факторов транскрипции GLK1 и/или GLK2 в реализации позитивного эффекта ЦК на формирование хлоропласта в ходе деэтиоляции через активацию экспрессии гена РНК-полимеразы SCA3.

Рис. 4.

Влияние света и цитокинина на уровень транскриптов ядерного гена SCA3, кодирующего хлоропластную РНК-полимеразу RPOTp (А), а также RPOTp-зависимых пластидных генов accD (Б) и clpP (В) в 4-дневных проростках A. thaliana дикого типа и нокаут-мутанта glk1glk2 в условиях темноты и в ходе деэтиоляции * – достоверные различия между средними значениями экспрессии в проростках, выращенных на питательной среде без цитокинина vs. экспрессии в растениях, обработанных транс-зеатином при *p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01.

Транс-факторы GLKs опосредуют активацию цитокинином экспрессии RPOTр – зависимых пластидных генов accD и clpP в ходе деэтиоляции A. thaliana. Дополнительным подтверждением участия транс-факторов GLKs в цитокинин-зависимой активации экспрессии гена SCA3 явились результаты ПЦР-РВ по уровню транскриптов RPOTp – зависимых генов, а именно accD и clpP в ходе цитокинин-зависимой деэтиоляции мутанта glk1glk2. Оба гена относятся к генам “домашнего хозяйства”: accD кодирует β-субъединицу ацетил-CоА-карбоксилазы, участвующей в синтезе жирных кислот, clpP – каталитическую субъединицу протеазы Clp. Ген accD имеет только NEP-промотор, поэтому транскрипция этого гена осуществляется NEP-полимеразой. Промотор clpP содержит как NEP, так и PEP элементы, что позволяет транскрибировать этот ген как NEP, так и РЕР- полимеразам, однако существуют данные о бо́льшем вкладе полимеразы NEP в транскрипцию гена clpP [2].

Анализ показал, что освещение проростков как дикого типа, так и нокаут-мутанта приводит к увеличению содержания транскриптов генов accD и clpP (рис. 4 б, в). Значимые отличия между диким типом и glk1glk2 наблюдались в динамике уровня мРНК генов accD и clpP в ответ на ЦК в ходе деэтиоляции: если в проростках материнской линии экзогенный ЦК увеличивал содержание транскриптов исследуемых генов во всех временных точках эксперимента, то инактивация генов факторов транскрипции GLKs у мутанта glk1glk2 приводила к отсутствию цитокинин-зависимой регуляции (рис. 4 б, в).

Отсутствие позитивного эффекта ЦК на содержание транскриптов гена SCA3 и двух RPOTp-зависимых генов accD и clpP у мутанта glk1glk2 подтверждает участие транс-факторов GLK1 и/или GLK2 в реализации позитивного влияния ЦК на формирование хлоропласта путем контроля пластидной РНК-полимеразы ядерного кодирования.

Как известно, ЦК обладают широким спектром функциональной активности. Начальный путь передачи цитокинового сигнала включает цитоплазматические рецепторы AHKs (Arabidopsis Histidine Kinase), трансмиттеры AHPs (Arabidopsis Histidine phosphotransfer Proteins) и 11 транс-факторов ARR типа В (Arabidopsis Response Regulator) [13]. Несмотря на то что транс-факторы типа В имеют от 4 до 8 тысяч прямых сайтов связывания с промоторами ядерных генов [14], многочисленные транскриптомные исследования указывают на гораздо более обширный кластер цитокинин-регулируемых генов, что допускает вовлеченность в гормон-зависимую экспрессию транс-факторов более высокого порядка.

К их числу относятся три семейства транс-факторов GATA ядерной локализации: GNC (GATA Nitrate-inducible Carbon-metabolism-involved), GNL/CGA1 (GNC-Like/Cytokinin-responsive GATA factor 1) и GLKs (Golden two-Like) [2, 15]. Эти регуляторные белки опосредуют действие ЦК на хлоропласты, и, кроме того, экспрессия их генов позитивно регулируется ЦК [3, 16]. Помимо участия в ЦК-зависимой регуляции экспрессии ядерных генов, GNC и GLKs контролируют биогенез и деление хлоропластов, однако молекулярный механизм такого воздействия различается. Фактор GNC подавляет транскрипцию генов негативных регуляторов фотоморфогенеза PIFs, а также генов, кодирующих ферменты биосинтеза и транс-факторов брассиностероидов, тем самым инициируя фотоморфогенез. Напротив, GLKs являются активаторами транскрипции генов, кодирующих белки светособирающих комплексов и ферменты биосинтеза хлорофилла. Полученные нами результаты впервые показали участие факторов транскрипции GLKs в цитокинин-зависимой активации экспрессии гена SCA3, что значительно углубляет понимание механизмов регуляции биогенеза хлоропластов транс-факторами GLKs.

Еще одним свето- и цитокинин-зависимым регулятором биогенеза хлоропластов является транс-фактор HY5. В исследованиях по зеленению корней A. thaliana Kobayashi и соавт. [10] показали взаимозависимость в действии факторов HY5 и GLKs. Это подтверждается тем, что экспрессия обоих генов подавляется ауксином и активируются ЦК, оверэкспрессия генов GLK1 и GLK2 приводит к увеличению уровня белка HY5 и белка светособирающего комплекса LHCP. Cкрещивание мутанта hy5-215 с растением оверэкспрессирующим GLK1_ox или GLK2_ox в некоторой степени компенсирует бледно-зеленый фенотип hy5-215, хотя не восстанавливает его полностью, из чего следует, что для функционирования транс-факторов GLKs необходим функционально-активный HY5. Кроме того, ранее мы показали [17], что цитокинин-зависимая экспрессия гена SCA3 в ходе деэтиоляции опосредована транс-фактором HY5, а в данной работе показана зависимость экспрессии гена RPOTp от факторов GLKs. По-видимому, белки GLKs и HY5 являются элементами одного транскрипционного каскада регуляции экспрессии гена SCA3, кодирующего РНК-полимеразу RPOTp пластид, в ходе цитокинин-зависимой деэтиоляции.