Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 383-386

Необходимость разработки новых противовирусных препаратов стала как никогда очевидной на фоне пандемии коронавируса SARS-CoV-2. Наряду с классическими низкомолекулярными ингибиторами вирусной активности [1] весьма перспективным представляется использование противовирусных препаратов, содержащих антитела или антителоподобные молекулы, которые можно получить практически для любого белкового антигена. Антителоподобные молекулы в этом плане могут быть более перспективными в связи с относительно небольшим, по сравнению с природными антителами, размером при сохранении нужной специфичности и аффиности [2]. В качестве мишени можно выбрать один из вирусных белков, критически важных для сборки вируса. Для вируса SARS-CoV-2 таким белком может быть нуклеокапсидный белок или N-белок, который связывается с вирусной РНК и принимает активное участие в сборке и упаковке вируса, а также имеет целый ряд других важных для вируса функций [3–5]. В предыдущей работе [6] нами было показано, что несколько антителоподобных молекул, монободи (Fn-N), к N-белку вируса SARS-CoV, созданных на основе десятого домена фибронектина 3 типа человека [7], способны с высоким сродством взаимодействовать с N-белком вируса SARS-CoV-2. Для неспецифической доставки данных монободи в клетки можно присоединить к ним проникающий в клетку пептид, например, ТАТ-пептид – пептид из белка трансактиватора транскрипции ВИЧ-1 [8]. Это было сделано для двух монободи Fn-N15 и Fn-N20, причем ТАТ-пептид был на N- или на С-конце конструкции. Из полученных конструкций отбиралась конструкция с наибольшим сродством к N-белку. Далее изучалась способность данной конструкции связываться с N-белком в клетках HEK293T. Для улучшения эффективности проникновения в клетки изучена также конструкция, содержащая вместо ТАТ-пептида шатл-пептид S10 [9].

Генно-инженерными методами были получены четыре плазмиды, каждая из которых содержала ген, кодирующий антителоподобную молекулу с His-тагом и ТАТ-пептид на N- или на С-конце. Плазмиды, кодирующие N-белок SARS-CoV-2 с His-тагом и N-белок SARS-CoV-2, слитый с флуоресцентным белком mRuby3, были любезно предоставлены компанией ShineGene (Китай) и доктором Raphael Gaudin (Addgene plasmid # 170466) соответственно. Экспрессию антителоподобных молекул, слитых с ТАТ-пептидом, и N-белка проводили в штамме E. coli BL21(DE3). Индукцию экспрессии Fn-N с ТАТ и N-белка проводили 500 мкМ IPTG в течение 20 ч при 37°C для Fn-N с ТАТ и в течение 3 ч при 37°C для N-белка. Fn-N с ТАТ и N-белок выделяли из нерастворимой фракции [10], а затем очищали аффинной хроматографией на носителях HisTrap FF для Fn-N с ТАТ и Protino® Ni-TED Resin для N-белка. Выделенные белки хранили в буфере 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 8.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле продемонстрировал достаточную степень чистоты полученных белков (98.9% для N-белка; 98.8% для ТАТ-Fn-N15; 96% для Fn-N15-TAT; 61.5% для TAT-Fn-N20; 97.5% для Fn-N20-TAT и 94.4% для S10-Fn-N15).

Взаимодействие полученных полипептидных конструкций с N-белком изучали так же, как описано в [6], методом термофореза на приборе Monolith NT.115 Series (“NanoTemper Technologies GmbH”, Германия) в буфере 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7. N-белок был помечен флуоресцентным красителем AF488, подобно тому, как это описано в [6]. Степень модификации составила 2.2 молекулы AF488 на одну молекулу N-белка. Клеточный анализ теплового сдвига проводили на клетках HEK293T, временно трансформированных N-белком, слитым с флуоресцентным белком mRuby3, подобно тому, как описано в [11], с тем исключением, что флуоресценцию образцов измеряли в капиллярах на приборе Monolith NT.115 Series (“NanoTemper Technologies GmbH”, Германия). Для каждой концентрации полипептида образец делили на четыре аликвоты. Количество клеток в аликвотах и процент трансфекции N-белком (20–30%), слитым с красным белком, определяли с помощью проточного цитофлуориметра MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec, Франция). Одну аликвоту не нагревали, а три другие нагревали до температур 45, 50 и 55°C, соответственно, в течение 3 мин. Далее аликвоты клеток лизировали четырьмя циклами замороживания в жидком азоте – оттаивания при 37°C. Для отделения от клеточных остатков и денатурированных белков лизированные клетки центрифугировали при 8000 g в течение 1 ч. Из флуоресценции каждого из супернатантов вычитали флуоресценцию используемого буфера, и полученную разность нормировали на число клеток в образце. Из такой нормированной флуоресценции вычитали значение фона, полученное для клеток HEK293T, не трансформированных N-белком. Полученное значение флуоресценции нормировали на флуоресценцию образцов, которые не подвергались нагреванию.

При фиксированной концентрации N-AF488 (40 нМ) методом термофореза были получены зависимости относительной флуоресценции (за 100% принята флуоресценция до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации полученных конструкций (рис. 1). Для каждого эксперимента получали четыре таких зависимости, и весь эксперимент повторяли два-три раза. По каждой кривой определяли константу диссоциации комплекса полипептидной конструкции с N-белком, ее усредняли по всем 8–12 кривым и определяли относительную ошибку ее измерения. Константы диссоциации комплексов конструкций с N-белком составили 46 ± 5, 710 ± 260,  350 ± 80  и  190 ± 90 нМ  для  конструкций TAT-Fn-N15, Fn-N15-TAT, TAT-Fn-N20 и Fn-N20-TAT соответственно. Таким образом, наилучшее сродство к N-белку наблюдается для  конструкции TAT-Fn-N15. Для конструкции S10-Fn-N15 (рис. 1) константа диссоциации с N-белком составила 700 ± 270 нМ.

Рис. 1.

Зависимости относительной интенсивности флуоресценции (за 100% принята интенсивность флуоресценции до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации полипептидных конструкций при постоянной концентрации N-белка (40 нМ). Указана среднеквадратичная ошибка определения относительной интенсивности флуоресценции (8–12 повторов).

Для изучения взаимодействия полученных конструкций с N-белком в клетке был использован вариант клеточного анализа теплового сдвига, в котором изменяется концентрация добавляемой полипептидной конструкции [12]. Такие зависимости были получены для конструкций TAT-Fn-N15 и S10-Fn-N15 на клетках HEK293T при разных температурах, например, 50°C (рис. 2а). Интерполяция сигмоидной кривой позволяет определить амплитуду перехода, ∆_t, и при любой концентрации конструкции – долю комплекса конструкции с N-белком при выбранной температуре, ∆/∆_t (рис. 2а). Эту долю можно линейной зависимостью экстраполировать до температуры 37°C (рис. 2б) и тем самым получить зависимости доли комплекса конструкции с N-белком от концентрации конструкции вне клеток при физиологических температурах (рис. 2в). Для конструкций TAT-Fn-N15 и S10-Fn-N15 по полученным кривым получили, что ЕС₅₀ = 10.1 ± 0.8 и 3.5 ± ± 0.8 мкМ соответственно (рис. 2в).

Рис. 2.

(а) Зависимость относительной интенсивности флуоресценции (по отношению к флуоресценции образца, не подвергающегося нагреванию) от концентрации конструкции TAT-Fn-N15, полученная нагреванием 3 мин при 50°C. Кривой показана интерполяция сигмоидной зависимостью. (б) Зависимость отношения доли комплекса TAT-Fn-N15 с N-белком, ∆, к амплитуде перехода, ∆_t, от температуры при 10 мкМ TAT-Fn-N15. Прямой линией показана интерполяция экспериментальных данных до температуры 37°C. (в) Зависимости доли комплекса S10-Fn-N15 или TAT-Fn-N15 с N-белком от концентрации конструкции вне клеток при физиологических условиях.

Таким образом, из четырех полученных конструкций (два монободи и ТАТ-пептид на N- или С-конце) конструкция TAT-Fn-N15 обладает наибольшим сродством к N-белку вируса SARS-CoV2 (константа диссоциации 46 ± 5 нМ). Клеточным анализом теплового сдвига было показано, что эта конструкция может проникать в клетки HEK293T и взаимодействовать в них с N-белком, слитым с флуоресцентным белком mRuby3. Включение в состав конструкции вместо ТАТ-пептида шатл-пептида S10 [9], который содержит как улучшенный ТАТ-пептид, так и эндосомолитический пептид, приводит к уменьшению втрое ЕС₅₀ (рис. 2в). Несмотря на то что сродство конструкции S10-Fn-N15 к N-белку в 15 раз хуже, чем конструкции TAT-Fn-N15, это с избытком компенсируется увеличением эффективности проникновения в клетки конструкции с S10, по сравнению с конструкцией с ТАТ-пептидом. Следует отметить, что ранее шатл-пептид S10 добавляли одновременно с доставляемой конструкцией, т.е. они не образовывали химической связи друг с другом [9]. В настоящей работе было показано, что S10 эффективен и в составе слитых конструкций. Однако в полученной конструкции S10 существенно ухудшает сродство монободи к N-белку. Дальнейшее повышение эффективности конструкции возможно путем повышения этого сродства, например, введением дополнительного спейсера между S10 и монободи или выбором другого монободи.

В результате проведенной работы нами было продемонстрировано, что наибольшей эффективностью взаимодействия с N-белком вируса SARS-CoV-2 в клетках HEK293T обладает конструкция S10-Fn-N15. Данная конструкция потенциально способна стать основной противовирусного препарата, нацеленного как на SARS-CoV, так и на SARS-CoV-2.