1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 506, № 1, 2022

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 392-395

СИНТЕЗ И ПРОТИВОГРИППОЗНАЯ АКТИВНОСТЬ (СО)ПОЛИМЕРОВ ВИНИЛФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ

В. В. Зарубаев 1, Е. В. Бучков 2, О. В. Назарова 3, Ю. И. Золотова 3, *, член-корреспондент РАН Е. Ф. Панарин 3

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера
Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
Санкт-Петербург, Россия

3 ФГБУН Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: incorporate@inbox.ru

Поступила в редакцию 15.06.2022
После доработки 08.07.2022
Принята к публикации 08.07.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Синтезированы новые сополимеры винилфосфоновой кислоты (ВФК) с 2-дезокси-2-метакриламидо-D-глюкозой, 4-акрилоилморфолином (4-АМ) и акриламидом, изучена их противовирусная активность в отношении вируса гриппа в опытах in vitro и in vivo. Оптимальными противовирусными характеристиками и низкой цитотоксичностью обладал сополимер ВФК с 4-АМ состава 56:44 мол. %, молекулярной массой 33 000. Полимер проявлял вирусингибирующие свойства с IC50 = 1 мкг/мл и индексом селективности 302. Профилактическое интраназальное применение полимера на модели гриппозной пневмонии у мышей полностью предотвращало специфическую смертность при гибели 90% животных в группе плацебо. Полученные результаты свидетельствуют о высоком противовирусном потенциале полимерных соединений на основе ВФК.

Ключевые слова: фосфорсодержащие полимеры, винилфосфоновая кислота, сополимеры, грипп, противовирусные соединения

Грипп, несмотря на очевидные успехи в области вакцинологии и химиотерапии, продолжает оставаться трудно контролируемой инфекцией. Это обусловлено особенностями самого возбудителя, в первую очередь, высокой скоростью эволюции, что приводит к ускользанию от иммунного ответа и формированию лекарственно-устойчивых мутантов [1]. Поэтому наряду со средствами специфической терапии применяются патогенетические препараты, направленные на подавление реактивных процессов, таких как цитокиновый шторм, воспалительная инфильтрация тканей органов-мишеней и пр. [2]. В этой связи поиск новых противовирусных лекарственных средств, в особенности неспецифических и эффективных в отношении вирусов разных антигенных групп, является приоритетной задачей медицинской науки.

Полимерные синтетические соединения проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе в отношении самых разных групп вирусов. Так, активность сульфатированных полисахаридов из морских водорослей, таких как галактансульфат, сульфатированный ксиломаннан, каррагенан и пр., была показана в отношении аденовируса, вируса гриппа, респираторно-синцитиального вируса, коронавируса и пр. [3]. Фосфат-содержащие полимеры синтезируются в клетках и являются одним из факторов противовирусной защиты, в частности, против вируса SARS-CoV-2 [4]. Сходную активность проявляют и синтетические полифосфаты против коронавируса [5, 6] и в отношении ВИЧ [7, 8].

Целью настоящего исследования были синтез новых синтетических полимеров на основе винилфосфоновой кислоты (ВФК) и оценка их противовирусной активности в отношении вируса гриппа в экспериментах на клеточной культуре и на модели гриппозной пневмонии у лабораторных животных.

Гомополимер ВФК и сополимеры с 2-дезокси-2-метакриламидо-D-глюкозой (МАГ), 4-акрилоилморфолином (4-АМ), акриламидом (АА) получали методом свободно-радикальной (со)полимеризации в запаянных стеклянных ампулах в атмосфере аргона в течение 24 ч. При проведении процесса в N,N-диметилформамиде (ДМФА) или метаноле в качестве инициатора использовали 2,2'-азобис-изобутиронитрил (ДАК), в водных растворах – 2,2'-азобис-(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (АМП). Полимеры очищали диализом против воды и выделяли методом лиофильной сушки.

Состав и структуру сополимеров устанавливали с помощью 1Н и 31Р ЯМР-спектроскопии в растворе D2О на спектрометре Bruker Avance 400 (Германия). В 1Н спектрах всех синтезированных сополимеров присутствовали сигналы обоих сомономеров, а в 31Р спектрах – сигнал ВФК. Для определения состава сополимеров в качестве внешнего стандарта использовали 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин, как описано в статье [9]. Молекулярные массы (МSD) определяли методом седиментации и диффузии. Данные по условиям синтеза и свойствам полученных полимеров приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Условия синтеза и характеристики (со)полимеров ВФК (M1)

N Условия (со)полимеризации Характеристики сополимеров
[M2] [M1]: [M2], мол. % [M1+M2], мас. % Растворитель I [I], мас. % от [M1+ M2] Выход, % [M1], мол. % МSD × 10–3
1* – 100:0 80 Н2О AMП 1 54 100 30
2 МАГ 50:50 10 ДМФА ДАК 2 71 12 20
3 МАГ 90:10 10 Н2О AMП 2 29 53 5
4 4-АМ 25:75 20 метанол ДАК 2 76 13 77
5 4-АМ 25:75 20 Н2О AMП 2 82 14 310
6 4-АМ 50:50 20 Н2О AMП 1 38 56 33
7 AA 25:75 20 ДMФА ДАК 2 93 28 25

24 ч, 60°C.

I – инициатор.

* 80°С.

Оценку цитотоксических и противовирусных свойств полимеров in vitro проводили как описано в [10].

В опытах использовали белых беспородных мышей (самки) массой 16–18 г из питомника “Рапполово” (Ленинградская обл.). Дизайн исследования утвержден Этическим Комитетом НИИЭМ им. Пастера (протокол № 7А от 15.02.2021). Навески полимера растворяли в физиологическом растворе и вводили животным (10 животных на группу) однократно интраназально (300 мкг/мл, 30 мкл на животное) за 1 ч до инфицирования. Животные контрольной группы (плацебо) получали 30 мкл физиологического раствора.

Мышей заражали интраназально под эфирным наркозом вирусом в дозе 5 × 103 TCID50 на мышь в объеме 30 мкл. Отдельную группу животных инфицировали вирусом в той же дозе, но предварительно инкубированным в течение 1 ч с раствором полимера (300 мкг/мл). Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Ежедневно фиксировали гибель животных. Достоверность различий в гибели животных оценивали при помощи критерия Мантела–Кокса при анализе кривых выживаемости Каплана–Мейера пакета программ GraphPad Prism v.6.01. Достоверными считали различия между группами, если параметр p не превышал 0.05.

Результаты изучения противовирусной активности и цитотоксичности фосфорсодержащих полимеров in vitro суммированы в табл. 2.

Таблица 2.

Цитотоксичность и противовирусная активность фосфорсодержащих полимеров в отношении вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) в культуре клеток MDCK

№ МSD, × 10–3 CC50, мкг/мл IC50, мкг/мл SI
1 (ВФК/100) 30 >330 1.3 ± 0.2 254
2 (ВФК: МАГ/12:88) 20 >330 280.0 ± 36.0 1.2
3 (ВФК: МАГ/53:47) 5 >330 15.5 ± 2.3 21.2
4 (ВФК: 4-АМ/13:87) 77 30.0 ± 2 >30 <1
5 (ВФК: 4-АМ/14:86) 310 >330 356.0 ± 44.0 <1
6 (ВФК: 4-АМ/56:44) 33 302.0 ± 15.0 1.0 ± 0.2 302
7 (ВФК: АА/28:72) 25 84.0 ± 6.0 72.0 ± 10.1 1.2

Из проанализированных максимальную активность (SI = 302) имело соединение 6. На биологические свойства полимеров влияли их химический состав и молекулярный вес. Так, токсичность полимеров 4 и 5, имеющих практически идентичное соотношение мономеров ВФК и 4-AM, различалась более чем на порядок, при этом бо̀льшую токсичность имел полимер меньшего молекулярного веса.

Результаты изучения динамики гибели животных суммированы в табл. 3 и представлены на рис. 1.

Таблица 3.

Активность фосфорсодержащего полимера 6 на модели летальной гриппозной пневмонии у мышей

Группа опыта Показатели смертности в группе
Погибших животных (пало/заражено) Смертность, % ИЗ p
Плацебо 9/10 90 – 1.0000
6 и/н 0/10 0 100 <0.0001
Инкубированный вирус* 9/10 90 0 0.6813

ИЗ – индекс защиты.

p – критерий Мантела–Кокса для попарных сравнений с группой плацебо.

и/н – интраназальное введение 6 за 1 ч до инфицирования вирусом.

* – животные заражены вирусом, предварительно инкубированным с 6.

Рис. 1.

Кривые выживаемости Каплана–Мейера в ходе гриппозной пневмонии у мышей, вызванной вирусом гриппа A/Puerto Rico (H1N1) в условиях применения фосфорсодержащего полимера 6. PR8+ полимер – животные заражены вирусом, предварительно инкубированным с полимером (300 мкг/мл) в течение 1 ч. Плацебо – животные получали интраназально физиологический раствор. Полимер и/н – животные получали интраназально раствор 6.

Заражение животных вирусом гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) приводило к их гибели, начиная с 5-х суток после инфицирования. К 14-м суткам эксперимента смертность животных в группе положительного контроля составила 90%. Предварительная инкубация вируса с изучаемым полимером не снижала показатели смертности животных (p = 0.6813), тогда как предварительная интраназальная обработка мышей раствором полимера приводила к 100% их защите от летальной гриппозной инфекции (p < 0.0001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен синтез и изучены свойства сополимеров винилфосфоновой кислоты (ВФК) с 2-дезокси-2-метакриламидо-D-глюкозой, акриламидом и 4-акрилоилморфолином (4-АМ) как потенциальных средств ингибирования инфекционной активности вируса гриппа. Показано, что оптимальными противовирусными характеристиками обладает сополимер ВФК с 4-АМ в соотношении 56:44 молекулярной массой 33 000. Полимер обладал низкой цитотоксичностью, проявлял вирусингибирующие свойства с IC50 = 1 мкг/мл и индексом селективности 302. Профилактическое интраназальное применение полимера на модели гриппозной пневмонии у мышей полностью предотвращало специфическую смертность при гибели 90% животных в группе плацебо. Ранее проведенные исследования свидетельствуют также о способности фосфорсодержащих полимеров к активации неспецифической противовирусной защиты организма [11], что может обусловливать комплексный механизм борьбы с гриппозной инфекцией при использовании полимеров изученного состава. Полученные результаты свидетельствуют о высоком противовирусном потенциале полимерных соединений на основе винилфосфоновой кислоты.

Список литературы

  1. Lampejo T. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020. V. 39. № 7. P. 1201–1208.

  2. Chow E.J., Doyle J.D., Uyeki T.M. // Crit Care. 2019. V. 23. № 1. P. 214.

  3. Jabeen M., Dutot M., Fagon R., Verrier B., Monge C.// Pharmaceutics. 2021. V. 13. № 5. P. 733.

  4. Schepler H., Wang X., Neufurth M., Wang S., Schröder H.C., Müller W.E.G. //Theranostics. 2021. V. 11. № 13. P. 6193–6213. https://doi.org/10.7150/thno.59535

  5. Neufurth M., Wang X., Tolba E., Lieberwirth I., Wang S., Schröder H.C., Müller W.E.G.//Biochem Pharmacol. 2020. V. 182. P. 114215.

  6. Müller W.E.G., Neufurth M., Wang S., Tan R., Schrö-der H.C., Wang X. // Mar. Drugs. 2020. V. 18. № 12. P. 639.

  7. Yang S., Pannecouque C., Herdewijn P. // Chem Biodivers. 2012. V. 9. № 10. P. 2186–2194.

  8. Pérez-Anes A., Stefaniu C., Moog C., Majoral J.P., Blanzat M., Turrin C.O., Caminade A.M., Rico-Lattes I. // Bioorg. Med. Chem. 2010. V. 18. № 1. P. 242–248.

  9. Nazarova O., Chesnokova E., Nekrasova T., Zolotova Yu., Dobrodumov A., Vlasova E., Fisher A., Bezrukova M., Panarin E. // Polymers. 2022. V. 14. № 3. P. 590.

  10. Smirnova I., Petrova A., Lobov A., Minnibaeva E., Phoung T.T.T., Van L.T., Khine M.M., Esaulkova I., Slita A., Zarubaev V., Kazakova O. The Journal of Antibiotics. 2022. V. 75. № 5. P. 258–267.

  11. Neufurth M., Wang X., Wang S., Schröder H.C., Mül-ler W.E.G. // Mar. Drugs. 2021. V. 19. № 2. P. 64.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал