1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 507, № 1, 2022

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 460-464

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ COVID-19 С МУТАЦИЯМИ БЕЛКА NS8 SARS-COV-2 В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ШТАММОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВИРУСА

М. Ю. Шкурников 1, 2, *, Д. А. Аверинская 1, А. Г. Комаров 3, И. А. Карбышев 3, Г. И. Спешилов 3, И. А. Штинова 3, Д. А. Дорошенко 4, В. И. Вечорко 4

1 НИУ Высшая школа экономики, Факультет биологии и биотехнологии
Москва, Россия

2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Москва, Россия

3 ГБУЗ “Диагностический центр (Центр лабораторных исследований) Департамента здравоохранения города Москвы”
Москва, Россия

4 ГБУЗ “Городская клиническая больница № 15 им. О.М. Филатова” Департамента здравоохранения
г. Москвы, Россия

* E-mail: mshkurnikov@hse.ru

Поступила в редакцию 08.08.2022
После доработки 14.08.2022
Принята к публикации 16.08.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

В середине 2021 г. штамм Дельта SARS-CoV-2 вызвал третью волну пандемии COVID-19. Огромные усилия были направлены на изучение влияния его мутаций на эффективность нейтрализующих антител. Значительно меньшее внимание было обращено на индивидуальные особенности презентации его пептидов молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I (ГКГС-I). В данном исследовании была изучена взаимосвязь HLA-I генотипа пациентов в возрасте не старше 60 лет с тяжестью течения COVID-19, вызванной двумя наиболее распространенными летом 2021 г. вариантами штамма Дельта SARS-CoV-2: AY.122 и B.1.617.2. Анализ тяжести течения COVID-19 выявил более тяжелое течение заболевания, вызванного вариантом AY.122. Сравнение профиля мутаций двух наиболее распространенных вариантов штамма Дельта показал, что наибольший вклад в способность ГКГС-I презентировать пептиды вируса вносит мутация G8R в белке NS8. Учитывая, что белок NS8 способен подавлять созревание молекул ГКГС-I, появление мутации в одном из его иммуногенных эпитопов, могло внести весомый вклад в превалирование варианта AY.122 в российской популяции.

Ключевые слова: COVID-19, NS8, ORF8, HLA, ГКГС-I, AY.122, B.1.617.2

ВВЕДЕНИЕ

В середине 2021 г. штамм Дельта коронавируса SARS-CoV-2 вызвал третью волну пандемии COVID-19 в ряде стран мира, в том числе и в России [1]. Резкий рост заболеваемости был связан с высокой трансмиссивностью нового штамма по сравнению с альфа-вариантом [2]. Возрастание трансмиссивности во многом было обусловлено увеличением до 6 раз по сравнению со штаммом Альфа количества выдыхаемых на пике инфекции зараженным человеком вирусных частиц [3]. Дельта-вариант увеличил не только риск госпитализации по поводу COVID-19, но и риск смерти у непривитых пациентов [4]. Штамм Дельта активно мутировал, что привело к формированию подштаммов, значительно отличающихся по профилю мутаций [1]. Данное обстоятельство крайне важно, так как изменения аминокислотной последовательности белков SARS-CoV-2 значимо влияют на способность молекул главного комплекса гистосовместимости класса I (ГКГС-I) презентировать их на поверхности зараженной клетки [5].

Молекулы ГКГС-I являются одними из ключевых медиаторов первых звеньев развития специфического иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2. Активная репликация и высвобождение вируса приводят к гибели зараженной клетки и поглощению ее остатков дендритными клетками и макрофагами. После фагоцитоза остатков погибших клеток и вирусных белков, содержащихся в них, дендритные клетки и макрофаги мигрируют в региональные лимфатические узлы и с помощью молекул ГКГС-I презентируют наивным цитотоксическим Т-лимфоцитам пептиды вируса SARS-CoV-2. В процессе презентации цитотоксические Т-лимфоциты получают сигнал активации и активно пролиферируют, образуя популяцию вирусоспецифических цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов (цтТ-лимфоцитов) [6]. Активированные цтТ-лимфоциты способны распознать зараженные вирусом SARS-CoV-2 клетки. Обнаружив на поверхности инфицированной клетки комплекс молекулы ГКГС-I и вирусного пептида, цтТ-лимфоциты разрушают ее с помощью перфоринов и сериновых протеаз [7], тем самым прерывая размножение вируса.

Существует три основных типа молекул ГКГС-I, кодируемых генами HLA-A, HLA-B и HLA-C (от англ. Human Leukocyte Antigen). В геноме человека каждый ген может быть представлен в двух вариантах (аллелях), унаследованных от родителей. В популяции существуют десятки вариантов каждого аллеля, кодирующих молекулы ГКГС-I с индивидуальной способностью взаимодействовать с чужеродными пептидами. Индивидуальные комбинации молекул ГКГС-I существенно влияют на тяжесть многих инфекционных заболеваний [6].

За более чем два года пандемии COVID-19 накоплена значительная информация об особенностях формирования Т-клеточного иммунитета к COVID-19 [8]. Однако ассоциации HLA-генотипа и течения COVID-19 преимущественно анализировали по данным, относящимся к первой волне пандемии и исходному штамму вируса. Более того, при исследованиях ассоциаций и тяжести течения COVID-19 практически не учитывался возраст переболевших. Необходимо отметить, что возраст является значимым фактором в формировании иммунного ответа к COVID-19 [9]. В частности показано, что у людей старше 60 лет в значительной степени снижается длина теломер наивных Т-лимфоцитов, что приводит практически к десятикратному падению их способности к делению при активации [10], сокращается репертуар Т-клеточного рецептора [11].

Ранее на выборке пациентов первой волны нами было показано, что генотип HLA-I является значимым фактором риска тяжелого течения COVID-19 только у пациентов в возрасте не старше 60 лет [6]. В данном исследовании мы изучили взаимосвязь HLA-I генотипа пациентов в возрасте не старше 60 лет с тяжестью течения COVID-19, вызванной двумя наиболее распространенными летом 2021 г. вариантами штамма Дельта SARS-CoV-2: AY.122 и B.1.617.2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 45 пациентов, госпитализированных по поводу COVID-19 в августе 2021 г. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ГБУЗ ГКБ № 15 им. О.М. Фи- латова ДЗМ. Все пациенты подписали информированное согласие.

Мазки из носо- и ротоглотки собирали в пробирки с транспортной средой. Для исследования образцов на наличие РНК SARS-CoV-2 применяли различные наборы реагентов для ОТ-ПЦР и комплектные к ним наборы для выделения РНК: ПОЛИВИР SARS-CoV-2 Express (ЛИТЕХ, Россия), АмплиПрайм SARS-CoV-2 DUO / МагноПрайм ФАСТ-Р (НекстБио, Россия) и SARS-CoV-2 “CoV-2-Тест” (ТестГен, Россия). Пригодными к секвенированию считали образцы c Ct менее 30.

Приготовление библиотек для секвенирования осуществляли с помощью панели праймеров и баркодов (“ДиаСистемс”, Россия). Панель праймеров содержала ген-специфические части из базы данных международного консорциума исследователей ARTIC network. Секвенирование осуществлялось на платформе Illumina MiSeq (Illumina) с использованием набора реагентов MiSeq 600 cycles v3, запускаемого в режиме чтения 2 × 250 п.о. Аннотирование последовательностей осуществлялось с применением баз данных Pango-lineage (версия 4.1.2) [12] и NextStain [13].

Определение HLA-генотипа осуществляли с помощью набора реагентов HLA-эксперт (ДНК-Технология, Россия), как описано ранее [6]. Анализ влияния мутаций на аффинность взаимодействия пептидов SARS-CoV-2 и молекул ГКГС-I осуществляли по протоколу T-CoV [14]. Последовательности белков подштаммов SARS-CoV-2 были получены из базы данных GISAID [15]: AY.122 (EPI_ISL_895058), B.1.617.2 (EPI_ISL_1315070).

Статистический анализ результатов осуществлялся в среде R с использованием критериев Вилкоксона и Хи-квадрат, а также точного теста Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В августе 2021 г. была сформирована выборка из 45 пациентов, госпитализированных со среднетяжелым и тяжелым течением COVID-19, проведено HLA-генотипирование и определена штаммовая принадлежность вируса SARS-CoV-2. Характеристика пациентов представлена в табл. 1. Секвенирование РНК, выделенной из мазков из носоглотки, позволило установить, что пациенты были инфицированы вариантами AY.122 и B.1.617.2 штамма Дельта SARS-CoV-2. По данным портала GISAID [15] выявленное нами соотношение вариантов SARS-CoV-2 характерно для московского региона в августе 2021 г. (отношение шансов 2.2, р = 0.1, 95% доверительный интервал 0.8–5.4).

Таблица 1.

Характеристика выборки пациентов с COVID-19

Показатель Вариант AY.122 Вариант B.1.617.2 p
n 37 8  
Возраст, медиана [25–75%] 35 [32–46] 45 [35–51.8] 0.26
Пол (муж./жен.) 10/27 1/7 0.65
Тяжесть 0.04
Средняя 14 8
Тяжелая 23 0
Максимальная степень поражения легких по КТ 0.37
КТ-0 3 0
КТ-1 10 4
КТ-2 5 1
КТ-3 9 0
КТ-4 3 0
н.д. 7 3
Исход 1
Летальный 1 0
Выписан 36 8
Диабет 8 2 1
Ожирение 7 1 1
Гипертония 8 2 1

Нам удалось установить, что тяжесть течения COVID-19 значимо различалась для больных вариантами AY.122 и B.1.617.2 (отношение шансов неопр., р = 0.4, 95% доверительный интервал 0.9 – неопр.). Мы проанализировали различия в профиле мутаций этих вариантов SARS-CoV-2 (рис. 1). В варианте AY.122 выявлено 12 мутаций: 6 мутаций в ORF1ab, две мутации во вспомогательных белках и четыре мутации в структурных белках. В свою очередь вариант B.1.617.2 несет 24 мутации: пять мутаций в ORF1ab, пять мутаций во вспомогательных белках и 14 мутаций в структурных белках. Необходимо отметить, что два варианта SARS-CoV-2 объединяют только две мутации: D614G в спайк-белке и P323L в РНК-зависимой РНК полимеразе из ORF1ab. Обе эти мутации закрепились в геноме SARS-CoV-2 еще в начале 2020 г. и ассоциированы с тяжестью течения COVID-19 [16]. Учитывая, что подавляющее большинство мутаций в вариантах вируса различаются, мы проанализировали их влияние на способность молекул ГКГС-I взаимодействовать с мутантными пептидами каждого варианта.

Рис. 1.

Профиль мутаций в вариантах AY.122 и B.1.617.2 SARS-CoV-2.

HLA-генотипирование пациентов показало, что наиболее частыми аллелями в выборке были HLA-A*02:01 (частота 0.26) и HLA-A*01:01 (частота 0.25), что характерно для популяции московского региона [6]. Малый объем выборки не позволил выявить взаимосвязи гаплотипов и отдельных аллелей с тяжестью течения COVID-19 для анализируемых вариантов SARS-CoV-2. Тем не менее был оценен индекс риска тяжелого течения COVID-19 [6], отражающий интегральную способность индивидуального набора молекул ГКГС-I презентировать пептиды SARS-CoV-2 (рис. 2, панель А). Различия в индексе риска между пациентами, переболевшими вариантом AY.122 в среднетяжелой и тяжелой форме, оказались недостоверными (p = 0.47). Однако можно отметить тенденцию к более высокому индексу риска у пациентов с тяжелым течением.

Рис. 2.

Панель а – взаимосвязь индекса риска тяжелого течения COVID-19 c фактическим течением заболевания. Панель б – влияние мутаций во вспомогательных белках вариантов AY.122 и B.1.617.2 на аффинность их взаимодействия с индивидуальным набором молекул ГКГС-I.

Анализ влияния мутаций на число вирусных пептидов, взаимодействующих с индивидуальным набором молекул ГКГС-I с аффинностью менее 50 нМоль, показал что, различия достоверны для вспомогательных белков вируса (рис. 2, панель Б). Так, у инфицированным вариантом AY.122 число высокоаффинных пептидов значимо сократилось по сравнению с инфицированными вариантом B.1.617.2 (p <0.01).

Значимое снижение числа высокоаффинных пептидов в варианте AY.122 прежде всего связано с мутацией G8R в белке NS8. Данная мутация вызывает падение аффинности взаимодействия пептидов FLGIITTV и FLVFLGIITTV с молекулой ГКГС-I, кодируемой наиболее частой для нашей популяции аллелью HLA-A*02:01. Ранее была показана иммуногенность пептида FLGIITTV у пациентов, переболевших COVID-19 [17]. Особого внимания заслуживает тот факт, что белок NS8 (ORF8) способен подавлять созревание молекул ГКГС-I и их транслокацию на поверхность зараженной клетки [18, 19]. Данные обстоятельства могли внести весомый вклад в превалирование варианта AY.122 в российской популяции и более тяжелое, по сравнению с другими вариантами штамма Дельта, течение COVID-19, вызванной им. Предлагаемый подход к анализу мутаций на уровне вариантов SARS-CoV-2 представляется очень важным, так как SARS-CoV-2 продолжает активно мутировать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Анализ взаимосвязи индекса риска тяжелого течения COVID-19, основанного на аффинности взаимодействия молекул ГКГС-I с пептидами вируса, c фактическим течением заболевания позволяет отметить тенденцию к более высокому индексу риска у пациентов с тяжелым течением.

2. Анализ влияния мутаций во вспомогательных белках штаммов AY.122 и B.1.617.2 на аффинность их взаимодействия с индивидуальным набором молекул ГКГС-I объясняет превалирование AY.122 в российской популяции и более тяжелое, по сравнению с другими штаммами Дельта, течение COVID-19, вызванной им.

3. Настоящее исследование демонстрирует дополнительные возможности эпидемиологического мониторинга имеющей очевидную тенденцию к активному распространению и выраженной изменчивости коронавирусной инфекции SARS-CoV-2.

Список литературы

  1. Klink G., Safina K.R., Nabieva E., et al. The rise and spread of the SARS-CoV-2 AY.122 lineage in Russia // Virus Evolution. 2022. V. 8. № 1.

  2. Callaway E. Delta coronavirus variant: scientists brace for impact // Nature. 2021. V. 595. № 7865. P. 17–18.

  3. Earnest R., Uddin R., Matluk N., et al. Comparative transmissibility of SARS-CoV-2 variants Delta and Alpha in New England, USA // Cell Reports Medicine. 2022. V. 3. № 4. P. 100583.

  4. Bast E., Tang F., Dahn J., et al. Increased risk of hospitalisation and death with the delta variant in the USA // The Lancet Infectious Diseases. 2021. V. 21. № 12. P. 1629–1630.

  5. Nersisyan S., Zhiyanov A., Zakharova M., et al. Alterations in SARS-CoV-2 Omicron and Delta peptides presentation by HLA molecules // PeerJ. 2022. V. 10. P. e13354.

  6. Shkurnikov M., Nersisyan S., Jankevic T., et al. Association of HLA Class I Genotypes With Severity of Coronavirus Disease-19 // Frontiers in Immunology. Frontiers, 2021. V. 12. P. 641900.

  7. Wherry E.J., Ahmed R. Memory CD8 T-Cell Differentiation during Viral Infection // Journal of Virology. 2004. V. 78. № 11. P. 5535–5545.

  8. Titov A., Shaykhutdinova R., Shcherbakova O.V., et al. Immunogenic epitope panel for accurate detection of non-cross-reactive T cell response to SARS-CoV-2 // JCI Insight. 2022. V. 7. № 9.

  9. Sanchez-Vazquez R., Guío-Carrión A., Zapatero-Gaviria A., et al. Shorter telomere lengths in patients with severe COVID-19 disease // Aging. 2021. V. 13. № 1. P. 1–15.

  10. Anderson J.J., Susser E., Arbeev K.G., et al. Telomere-length dependent T-cell clonal expansion: A model linking ageing to COVID-19 T-cell lymphopenia and mortality // eBioMedicine. 2022. V. 78. P. 103978.

  11. Britanova O., Putintseva E., Shugay M., et al. Age-Related Decrease in TCR Repertoire Diversity Measured with Deep and Normalized Sequence Profiling // The Journal of Immunology. 2014. V. 192. № 6. P. 2689–2698.

  12. O’Toole Á., Scher E., Underwood A., et al. Assignment of Epidemiological Lineages in an Emerging Pandemic Using the Pangolin Tool // Virus Evolution. 2021.

  13. Hadfield J., Megill C., Bell S.M., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution // Bioinformatics. 2018. V. 34. № 23. P. 4121–4123.

  14. Nersisyan S., Zhiyanov A., Shkurnikov M., et al. T-CoV: a comprehensive portal of HLA-peptide interactions affected by SARS-CoV-2 mutations // Nucleic Acids Research. 2022. V. 50. № D1. P. D883–D887.

  15. Elbe S., Buckland-Merrett G. Data, disease and diplomacy: GISAID’s innovative contribution to global health // Global Challenges. 2017. V. 1. № 1. P. 33–46.

  16. Biswas S.K., Mudi S.R. Spike protein D614G and RdRp P323L: the SARS-CoV-2 mutations associated with severity of COVID-19 // Genomics & Informatics. 2020. V. 18. № 4. P. e44.

  17. Saini S.K., Hersby D.S., Tamhane T., et al. SARS-CoV-2 genome-wide T cell epitope mapping reveals immunodominance and substantial CD8+ T cell activation in COVID-19 patients. // Sci Immunol. 2021. V. 6. № 58.

  18. Zhang Y., Chen Y., Li Y., et al. The ORF8 protein of SARS-CoV-2 mediates immune evasion through down-regulating MHC-I // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2021. V. 118. № 23.

  19. Matsuoka K., Imahashi N., Ohno M., et al. SARS-CoV-2 accessory protein ORF8 is secreted extracellularly as a glycoprotein homodimer // Journal of Biological Chemistry. 2022. V. 298. № 3. P. 101724.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал