Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 455-459

Пандемия COVID-19 и появление новых вариантов ее этиологического агента – вируса SARS-CoV-2 – делает актуальными исследования по поиску эффективных средств профилактики и лечения этой инфекции. На начальных стадиях взаимодействия вируса с клеткой ключевую роль играет белок S, который формирует шипы на поверхности вирусной частицы. Рецептор-связывающий домен (RBD) белка S взаимодействует с интерфейсом клеточного рецептора ACE2, состоящим из α-спиралей h1 и h2, и запускает слияние клеточной и вирусной мембран для проникновения вирусного генома в цитоплазму клетки [1]. На настоящий момент для ингибирования этого взаимодействия разработаны и применяются в клинической практике моноклональные антитела с нейтрализующей активностью [2–4], которые в дальнейшем станут препаратом сравнения для новых соединений. Одним из подходов к дизайну молекул, способных по конкурентному механизму предотвращать связывание RBD SARS-CoV-2 и родственных ему вирусов с ACE2, является конструирование пептидов, имитирующих структуру и свойства клеточного рецептора АСЕ2. В 2020–2022 гг. изучено значительное количество пептидных молекул на основе последовательности АСЕ2 и нацеленных на взаимодействие с белком S [5] методами in silico, и только для некоторых из них эффективность ингибирования образования комплекса RBD-АCE2 и (или) противовирусная активность были исследованы in vitro. Более того, всего несколько синтезированных структур, проявивших высокую (наномолярную) аффинность связывания in silico [6] и in vitro [7, 8], проявили противовирусную активность на клеточных моделях или животных [9–12].

Для повышения эффективности связывания необходимо оптимизировать структуру пептида с целью создания молекулы, наиболее близко воссоздающей структуру АСЕ2, обеспечивающую высокоаффинное взаимодействие с RBD [13–15]. Нами были разработаны и синтезированы мономерные пептиды на основе аминокислотной последовательности антипараллельных α-спиралей h1 и h2 ACE2 с модифицированными остатками. Мономерные пептиды были соединены дисульфидными мостиками по различным положениям для получения гетеродимерных “химерных” пептидов X1-4 (табл. 1; синтез пептидов X1, X2 и их мономеров описан ранее [16]). Для этих пептидов проведены экспериментальные исследования растворимости, аффинности связывания с RBD и степени спирализации, а также моделирование молекулярной динамики в различных растворителях.

Таблица 1.

Структура и свойства изучаемых пептидов

Код, комментарий	Последовательность	α-спираль- ность, %а			Kd связывания с RBD, µMб
		H2O	ВСС	ТФЭ	H2O	ВСС
Спираль h1
MTI–23 (SPB1, контроль)	IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQS-NH2	6.0	44.4	79.8	NB	3.57 ± 1.78
h1–D–Cys (21–42) h1	cEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYk	6.2	39.2	72.5	–	–
h1–Mpa (21–42) h1	IEEQAKTFLDK[Mpa]FNHQAEDLFYk	6.0	37.8	85.3	NB	1.07 ± 0.36
200h1 (21–44) h1	IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQCS	3.9	40.3	52.4	NB	3.10 ± 1.03
900h1 (21–44) h1	IEEQAKTFLDEFNEEAEDLFYQCS	NS*	37.2	73.7	NB	3.45 ± 2.42
Спираль h2
h2 (67–89) h2	DKWSAFLKEQSTIAQ-Nle-YPLQECI	8.0	45.5	62.0	40 ± 8	2.58 ± 1.11
h2–Cys (67-89) h2	DKWSAFLKECSTIAQIYPLQEI	6.9	38.2	70.2	NB	3.87 ± 1.94
900h2 (64–87) h2	NCGDKWSAFLKEQSTLAQ-Nle-YPLQE	7.2	51.6	65.2	1.7 ± 0.4	7.22 ± 3.61
Димерные пептиды
X1 (h1–D–Cys – h2)		8.0	41.1	95.2	4.2 ± 0.5	7.39 ± 5.54
X2 (h1–Mpa – h2–Cys)		NS	51.7	82.5	12 ± 5	0.929 ± 0.371
X3 (200h1 – 900h2) Cys43(h1)–Cys65(h2)		NS	55.0	98.0	NB	–
Х4 (900h1 – 900h2)		8.8	62.8	100.0	NB	0.882 ± 0.353

NB – нет связывания в исследованном диапазон концентраций; NS – исследование не проведено из-за нерастворимости пептида; – исследование не проводилось; а – по данными спектроскопии КД; б – по данным термофореза.

Исследование аффинности проводили методом микротермофореза [17], а исследование степени α-спиральности – с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД) [18] (табл. 1). Синтезированные пептиды обладают низкой растворимостью в воде. В водном растворе аффинность к RBD проявляли только два химерных пептида (Kd X1: 4 мкМ, X2: 12 мкМ) и два мономерных пептида на основе спирали h2 (константы диссоциации Kd составили h2: 40 мкМ, 900h2: 2 мкМ). Методом КД было установлено, что пептиды в водном растворе имеют низкую степень спиральности, что может являться причиной их низкой аффинности к RBD.

Стабилизация элементов вторичной структуры в пептидах и белках, в частности, α-спиралей, – это комплексный многофакторный процесс, в котором участвуют несколько различных механизмов. К индуцирующим спирализацию эффектам относят уменьшение энтропийного вклада молекул растворителя в сворачивание спиралей за счет разрушения сети водородных связей между ними и боковыми цепями аминокислотных остатков пептида.

Для повышения степени спирализации синтезированных пептидов были подобраны растворители, стабилизирующие их α-спиральную конформацию, а также пригодные для биологических экспериментов.

Наиболее подходящим для поддержания устойчивой спиральной конформации пептидов является трифторэтанол (ТФЭ) [19]. Степень спиральности пептидов в ТФЭ была наиболее высокой: от 50 до 100%. При этом димерные пептиды Х3 и Х4 в ТФЭ сохраняют полностью спиральную конформацию. Этот растворитель может быть использован для характеристики общей способности пептида к спирализации. Однако ТФЭ токсичен для культур клеток и в высокой концентрации непригоден для проведения исследований in vitro.

Методом КД была подтверждена более высокая степень спиральности пептидов в водно-спиртовой смеси (37–63%) по сравнению с водой. В водно-спиртовой смеси мономерные пептиды проявляют аффинность к RBD с константами диссоциации в диапазоне 1–4 и 2–8 мкМ для пептидов на основе последовательности α-спирали h1 и h2 соответственно. Объединение мономерных пептидов в гетеродимеры приводит к повышению аффинности при соединении “середина к середине” или “хвост к голове” (константы диссоциации дипептидов X2 и X4 <1 мкМ), однако не влияет на аффинность при соединении “голова к хвосту” (константа диссоциации дипептида X1 ~7 мкМ) (табл. 1). Кроме того, димерные пептиды обладают более высокой степенью спиральности, чем мономерные, что может быть следствием взаимного стабилизирующего влияния спиралей h1 и h2 друг на друга.

При моделировании молекулярной динамики (100–300 нс) в воде пептиды, особенно мономерные, проявляют склонность к дестабилизации структуры и потере спиральной конформации (рис. 1).

Рис. 1.

Репрезентативные структуры мономерных пептидов 200h1 (а) и 900h2 (б) и полученного из них химерного пептида X3 (в) по результатам моделирования молекулярной динамики. Структуры в воде, ВСС и ТФЭ окрашены голубым, красным и желтым цветом, соответственно, и совмещены по наибольшему структурному подобию. Наложение структур 200h1 оказывается невозможным в силу принципиального отличия конформаций.

Степень спиральности и стабильности химерных пептидов в воде оказывается значительно выше, чем у мономерных, что поддерживает гипотезу о взаимной стабилизации спиралей в гетеродимерах. В водно-спиртовой смеси и в ТФЭ спиральная конформация остается достаточно стабильной в течение всего времени моделирования как для мономерных, так и химерных пептидов. Это указывает на возможность дополнительной стабилизиции cпиральной структуры за счет свойств этих растворителей, частично имитирующих особенности белкового окружения спиралей в структуре рецептора.

Предложенные димерные пептиды на основе спиралей h1 и h2 рецептора ACE2, соединенных дисульфидными мостиками, способны к связыванию с RBD S-белка SARS-CoV-2 с аффинностью в субмикромолярном диапазоне, превышающей аффинность индивидуальных мономеров. Образование спиральной структуры пептидов приводит к повышению эффективности связывания с RBD SARS-CoV-2: аффинность пептидов к RBD зависит от степени α-спиральности их вторичной структуры, и сохранность исходной спиральной структуры, присущей рецептору АСЕ2, необходима для успешного связывания с RBD S-белка SARS-CoV-2. Водно-спиртовая смесь (ВСС) поддерживает спиральность пептидов и может быть использована для проведения исследований in vitro. Дальнейшая стабилизация структуры пептидов и подбор оптимальной аминокислотной последовательности и растворителя позволят создать кандидатные молекулы для исследования взаимодействия SARS-CoV-2 и рецептора in vivo.