Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 509, № 1, стр. 181-185

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что липиды принимают участие в развитии адаптивных изменений у живых организмов и особенно у гидробионтов, биохимические адаптации у которых обусловлены полной зависимостью от среды и принадлежностью к группе эктотермных животных. Адаптивная роль структурных липидов, к которым относятся фосфолипиды (ФЛ), разнообразна как по регулируемой ими функции, так и по механизму действия. Качественные и количественные модификации ФЛ и их жирных кислот (ЖК) обусловливают т.н. “текучесть” биомембран, необходимую для функционирования большого числа мембраносвязанных энзиматических систем [1–4]. С изменением текучести мембраны меняется температура фазового перехода липидов, влияющих на активность большинства мембраносвязаных ферментов – цитохромоксидазы, глюкозо-6-фосфатазы, сукцинатдегидрогеназы, Na⁺,K⁺-АТФ-азы, Ca²⁺-АТФ-азы, аденилатциклазы и др. [4]. Так, одной из функций мембран является их участие в биоэнергетических процессах и, прежде всего, в продуцировании АТФ на внутренней мембране митохондрий. Многие ферменты энергетического обмена работают только в определенном по составу и физико-химическим свойствам липидном окружении [2]. Например, для митохондриальной мембраны красных мышц форели показано трехкратное преобладание количественного содержания ФЛ над холестерином, при этом ФЛ представлены такими классами, как фосфоатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, лизофосфатидилхолин, а сфингомиелин представлен в ничтожно малых количествах [5]. ФЛ митохондриальных мембран рассматриваются в качестве структурных липидов и могут выполнять функцию потенциальных модуляторов и регуляторов процессов, протекающих в митохондриях, а также выступают “партнерами” митохондриальных белков [6].

Принимая во внимание участие липидов и в том числе отдельных ФЛ в биохимических адаптациях рыб к изменению факторов среды, и, учитывая важную роль светового режима и трофического фактора в раннем развитии лососевых рыб [7–9], исследовали влияние различных режимов кормления и освещения (естественного и непрерывного) на фосфолипидный состав сеголеток атлантического лосося, выращиваемых в товарной аквакультуре в летне-осенний период в Северной Осетии-Алании.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование влияния фотопериода на рост и развитие сеголеток (0+) атлантического лосося проводили на предприятии ООО “Остров аквакультура” (Республика Северная Осетия-Алания). Для стимуляции эндогенных механизмов, влияющих на ростовые процессы, во все бассейны с сеголетками (после перехода на экзогенное питание) было установлено непрерывное освещение (24LD) с использованием светодиодных осветителей LED (36W, 6500K). Кормление проводилось в круглосуточном режиме каждые два часа с использованием коммерческого корма марки Scretting Nutra HP (Италия) c 6 по 29 сентября и BioMar Inicio+901 (Дания) с 23 сентября по 15 ноября (фракция 1 и 1.5 в зависимости от веса рыб), оба корма схожи по составу и пищевой ценности; расчет корма проводили согласно нормам возрастной группы и с учетом биомассы. В августе сеголеток средней массой 2.3 г пересадили в выростные лотки размером 4 × 1.2 м, объемом 2.5–2.7 м³, в количестве 4900 особей/лоток. C начала сентября сеголеток разделили на три группы по 2 лотка и стали содержать в следующих (экспериментальных) условиях: контроль – режим освещения постоянный (24LD), кормление круглосуточное (КК); опыт № 1 – естественное освещение (ЕстLD), кормление проводится в светлое время суток (с 06:00 до 18:00 в сентябре, с 08:00 до 18:00 в октябре, с 08:00 до 17:00 в ноябре), через каждые два часа (КД); опыт № 2 – режим освещения постоянный (24LD), кормление проводится только в светлое время суток как у рыб из опыта №1 (КД). Для исследования отбирали сеголеток лосося 6 сентября (стартовая дата забора материала), 6 октября и 9 ноября; из каждой группы было взято до 15 особей из лотка.

Экстракцию липидов из отобранных образцов (сеголеток целиком) молоди лосося проводили по методу Фолча [10]. Качественное и количественное определение индивидуальных фосфолипидных фракций – фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС), фосфатидилинозитола (ФИ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СФМ) – осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием жидкостного хроматографа “Стайер” (ООО “Аквилон”, Россия). Фракционирование общих ФЛ проводили на колонке размером 250 × 4 мм, наполненной сорбентом Нуклеосил 100-7 (“Элсико”, Россия) и с использованием в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил-метанол-гексан-85% фосфорная кислота (918:30:30:17.5 по объему) при скорости потока 1 мл/мин. Детектирование анализируемых липидных классов осуществляли на спектрофотометре по поглощению в ультрафиолетовом свете при длине волны 206 нм [11]. Качественная идентификация липидных классов осуществлялась по стандартам соответствующих компонентов (Sigma-Aldrich, США) с учетом соответствия значений Rf. Исследования выполнены на базе лаборатории экологической биохимии и с использованием оборудования Центра коллективного пользования ФИЦ “Карельский научный центр Российской академии наук”.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием языка программирования “R” (v. 3.6.1.) в среде разработки “RStudio” с применением дополнительных пакетов: “readxl” (v. 1.3.1), “tidyverse” (v. 1.3.0) [12, 13]. Для описания количественного содержания индивидуальных фосфолипидных классов были рассчитаны параметры описательной статистики (среднее арифметическое и ошибка среднего арифметического) с группировкой по месяцам и типу экспериментального освещения. Полученные результаты были визуализированы в виде временной диаграммы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение исследованных индивидуальных фосфолипидных классов в мышечной ткани сеголеток в условиях различного освещения и кормления в летне-осенний период показаны на рис. 1.

Рис. 1.

Динамика некоторых фосфолипидных классов (% сухого вещества) у сеголеток атлантического лосося в контрольном и опытных вариантах в период с сентября по ноябрь.

У сеголеток из трех исследованных вариантов (контроль, опыт № 1 и опыт № 2) за период с сентября по ноябрь доминирующими ФЛ являлись ФХ и ФЭА, при этом показана общая тенденция к снижению данных ФЛ к ноябрю. Ранее [14] была показана динамика снижения общих ФЛ наряду с восками, диацилглицеринами, свободными жирными кислотами, холестерином у сеголеток в контроле и двух опытных вариантах в ноябре по сравнению с таковым в сентябре и октябре на фоне недостоверного и незначительного снижения триацилглицеринов (ТАГ). Известно, что как процесс подготовки к смолтификации и собственно смолтификация сопровождаются снижением количества общих липидов [15], в условиях настоящего эксперимента снижение ОЛ проходило за счет ФЛ, в частности мажорных по количеству ФХ и ФЭА. Несмотря на то что ФЛ относятся к структурным липидам, они, наряду с другими энергетическими липидами, являются и формой запасания энергии, которая реализуется в соответствии с потребностями организма и обеспечивает, поддержание гомеостаза в условиях изменяющихся факторов среды (в данном случае – освещения и кормления). ФИ, ФС, а также СФМ и ЛФХ (“минорные” классы ФЛ) у сеголеток атлантического лосося во всех вариантах эксперимента представлены в меньшем количестве. Для них, как и для доминирующих липидов, обнаружено снижение содержания у рыб в сезонном аспекте. Известно, что изменение активности Ca²⁺-АТФазы и особенно Na⁺,K⁺-АТФазы, который является “ферментом осморегуляции” и представляет из себя электрогенный ионный насос [16], регулируется именно за счет ФС, что особенно важно для рыб, которые испытывают флуктуации солености среды как на отдельных этапах жизненного цикла, так и в виде суточных или сезонных колебаний. Известно также, что ФС биомембран посредством регуляции активности мембранносвязанных ферментов принимает участие в процессах слияния миобластов для формирования миотрубки, системной единицы мышечного волокна, слияния остеокластов [17], чем в том числе можно частично объяснить прирост массы сеголеток лосося в процессе роста и развития, особенно в контрольном варианте эксперимента [14].

Установлено недостоверное снижение содержания ФИ у сеголеток контрольного варианта, при этом у рыб из опытных вариантов оно достоверно резко снижается к октябрю, а в ноябре снижение этого показателя недостоверно по сравнению с таковым в октябре (рис. 1). В процессе гидролиза ФИ при участии фосфолипазы С образуются диглицериды, которые считаются сигнальными молекулами [18], и фосфоинозиты, которые образуются под действием гормонов и ряда других эффекторов [19]. Показано [20], что последние увеличивают количество внутриклеточного Ca²⁺ и диглицеридов, что приводит к повышению активности киназ, которые выступают в роли регуляторов отдельных метаболических путей. Таким образом, ФИ является “поставщиком” в организм метаболически и функционально значимых молекул как в рамках нормального физиологического состояния, так и при условиях, которые требуют адаптивного компенсаторного ответа. Инозитол-липиды формируют липидный профиль биомембраны и поддержание ее гомеостаза [21]. Они участвуют в передаче трансмембранного сигнала, регулируют ионную проницаемость, суб- и межклеточный транспорт, а также являются предшественниками сигнальных молекул (при участии фосфолипазы С) [21]. В целом ФИ рассматривают как источник высоконенасыщенных биоактивных молекул ЖК, в частности арахидоновой ЖК. Эта ЖК предшественник одного из семейств эйкозаноидов, биологически активных соединений липидной природы, синтезируемых в большинстве тканей организма и участвующих в регуляции ряда физиологических процессов: репродукции, иммунного ответа, воспалительных реакций, развития и функционирования зрительной и нервной системы [22–25]. В аналогичном эксперименте [14] показан высокий и константный уровень арахидоновой кислоты у сеголеток всех вариантов эксперимента на всем протяжении эксперимента.

Таким образом, снижение (сентябрь–ноябрь) содержания исследованных фосфолипидов (ФХ, ФЭА, ФИ, ФС, ЛизоФХ, СФМ) наряду с другими, ранее описанными вариациями липидов и жирных кислот [14] у сеголеток атлантического лосося, впервые выращиваемого в условиях аквакультуры в регионе Северная Осетия-Алания, следует рассматривать прежде всего как биохимическую адаптацию развития, готовности молоди к предстоящей смолтификации и переходу из пресной среды в морскую. Обнаруженные изменения ФЛ-состава могут обеспечивать поддержание физико-химического состояния биомембран, которое удовлетворяет скоростям и уровням происходящих в них процессов на данном этапе развития молоди лосося в соответствующих условиях среды. Эффекты режима освещения и кормления на ФЛ состав сеголеток в процессе развития обнаружены главным образом для рыб, находящихся при постоянном режиме освещения и круглосуточном кормлении и рыб, выращиваемых при естественном освещении и кормлении в светлое время суток, однако наблюдаемые изменения не являлись специфическими для конкретной экспериментальной группы рыб в рамках настоящего исследования.