Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 509, № 1, стр. 186-190

Жасмоновая кислота и ее производные, в частности, метилжасмонат, представляют собой семейство циклопентаноновых соединений, которые образуются из α-линоленовой кислоты через октадеканоидный путь [1]. Как и другие фитогормоны, МЖ играет важную роль в процессах роста и развития растений и сигналинге [2]. К настоящему времени достаточно хорошо изучена роль жасмонатов в повышении устойчивости растений к биотическим факторам [3]. За последние годы накопились данные и об их протекторном действии в отношении таких абиотических факторов, как засуха, засоление, ультрафиолетовое излучение, низкие и высокие температуры [4]. Появились также работы, указывающие на положительное влияние жасмонатов на устойчивость растений к тяжелым металлам [5]. Например, обнаружено, что в условиях действия на растения тяжелых металлов жасмонаты усиливают экспрессию генов ферментов аскорбат-глутатионового цикла, белков теплового шока и PR-белков, а также способствуют повышению активности ряда антиоксидантных ферментов и увеличению содержания пролина [3], что в конечном счете приводит к повышению металлоустойчивости растений. Показано также участие жасмоната в регуляции активности ряда транскрипционных факторов (HLH, MYCs, MYB, WRKY и др.), которые в свою очередь активируют каскад реакций, в том числе направленных на увеличение устойчивости растений к разным стресс-факторам, включая тяжелые металлы [1].

Как известно, одним из наиболее важных механизмов адаптации растений к воздействию тяжелых металлов, в частности к кадмию, является связывание его ионов различными хелаторами в цитоплазме клетки, среди которых ключевую роль играют глутатион и фитохелатины [6]. В синтезе этих соединений участвует ряд ферментов, в том числе глутатионсинтетаза и фитохелатинсинтаза соответственно. Поскольку МЖ, как указано выше, способствует повышению устойчивости растений к кадмию, логично ожидать, что обработка им растений может оказывать положительное влияние на экспрессию генов синтеза этих ферментов (GS1 и PCS1). Однако в известной нам литературе таких данных нет. Учитывая это, целью нашей работы явилось изучение влияния экзогенного МЖ на экспрессию генов GS1 и PCS1 в листьях растений пшеницы, подвернутых действию ионов кадмия.

Впервые было показано, что предобработка растений пшеницы экзогенным МЖ приводит к повышению уровня транскриптов генов GS1 и PCS1, контролирующих синтез непротеиновых тиолов, в листьях еще до начала воздействия кадмия. При действии кадмия она усиливала экспрессию гена GS1, тогда как уровень транскриптов гена PCS1 в этих условиях не менялся. Полученные результаты, наряду с данными о меньшем содержании кадмия у обработанных МЖ проростков, свидетельствуют об участии этого гормона в формировании устойчивости растений к кадмию за счет более эффективного его хелатирования и меньшего содержания в корнях и побегах.

Исследования проводили на проростках озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Московская 39, которые выращивали в течение 7 сут на питательном растворе Хогланда-Арнона (pH 6.2–6.4) при температуре воздуха 22°C, относительной влажности 60–70%, освещенности 180 мкмоль/(м² с) ФАР и фотопериоде 14 ч. В дальнейшем контрольные растения продолжали расти в этих же условиях. Опытные растения делили на две части, одну из которых переносили на раствор МЖ (1 мкМ “Sigma-Aldrich”, США), а другая оставалась в прежних условиях. Спустя сутки все опытные растения были перенесены на питательный раствор, содержащий 100 мкМ кадмия (CdSO₄, “Нева Реактив”, Россия) на 7 сут, сохраняя прочие условия неизменными. Варианты опыта: К (контроль) – растения, находящиеся в условиях оптимального минерального питания; Cd – растения, подвергнутые действию кадмия без предобработки экзогенным МЖ; МЖ + Cd – растения, предобработанные экзогенным МЖ и затем подвергнутые действию кадмия. Концентрации МЖ и кадмия были выбраны на основании предварительных экспериментов.

При измерении ростовых показателей и определении сухой биомассы растений использовали общепринятые методы. Содержание кадмия анализировали с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра (АА-7000, Shimadzy, Япония).

Количество транскриптов генов GS1 и PCS1 определяли в листьях растений. Тотальную РНК выделяли из 50 мг растительного материала с помощью набора ExtractRNA (“Евроген”, Россия). Для удаления остатков ДНК препарат РНК обрабатывали ДНКазой, кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции с М-MLV обратной транскриптазой и случайными (random) гексапраймерами (“Евроген”). Количество и качество нуклеиновых кислот проверяли спектрофотометрически на приборе SmartSpecPlus (“Bio-Rad”, США). Уровень экспрессии генов оценивали с помощью ПЦР в режиме реального времени на приборе CFX (“Bio-Rad”), используя наборы для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green (“Евроген”). В качестве референсного гена использовали actin. Для проведения ПЦР использовали следующие праймеры. GS1 (AF093752), п – 5'-aactattaggaaaaccttgtcag-3', о – 5'-gaatcttcttggtcccgactaaa-3'; PCS1 (AB181991), п – 5'-cctcgcctccctctccgtcgtgc-3', о – 5'-agtcgtggatggtggtctggtcc-3'; Actin (AJ579382), п – 5'-gggacctcacggataatctaatg-3', о – 5'-aacctccactgagaacaacattac-3'. Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР фрагментов. Эффективность ПЦР, оцениваемая по стандартной кривой, достигала 98%. Уровень транскриптов генов вычисляли по ∆∆С_Т. В каждом опыте использовали от 3 до 6 повторностей, опыт повторяли трижды. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica (StatSoft Inc., США). Различия оценивали на основании F-критерия Фишера. В статье обсуждаются только величины, статистически значимые при р < 0.05.

Проведенное исследование показало, что под влиянием кадмия, независимо от обработки МЖ, рост растений тормозится (по сравнению с контролем), что наиболее отчетливо проявляется спустя 7 сут экспозиции (табл. 1). При этом высота побега у обработанных экзогенным МЖ проростков и у необработанных уменьшалась примерно в равной степени, тогда как снижение биомассы побега в большей степени наблюдалось у необработанных растений.

Аналогичный эффект МЖ наблюдали и другие авторы при действии кадмия на растения риса, мяты и горчицы [7]. Так, предобработка экзогенным МЖ не влияла на линейные размеры растений риса, подвергнутых действию кадмия, но их биомасса оказалась выше у обработанных растений по сравнению с необработанными [8]. Одной из возможных причин такого эффекта может быть положительное влияние МЖ на фотосинтетический аппарат растений, выражающееся, в частности, в увеличении содержания фотосинтетических пигментов [9] и повышении активности ряда ферментов, участвующих в темновых реакциях фотосинтеза [10]. Кроме того, имеются единичные сведения о том, что предобработка растений МЖ препятствовала поступлению кадмия в подземные и надземные органы [7], хотя механизмы воздействия гормона на поступление металла в растения авторами не обсуждались. В наших опытах у проростков, обработанных МЖ, содержание кадмия и в корнях, и листьях также оказалось гораздо меньше, чем у необработанных растений (табл. 2).

Известно, что одним из механизмов, препятствующих поступлению кадмия в растения, является повышение лигнификации клеточных стенок. Поскольку обработка растений МЖ приводит к увеличению в клеточных стенках содержания ферруловой кислоты [11], которая является одним из продуктов, образующихся в ходе синтеза лигнина, возможно, что именно усиление лигнификации способствовало, по крайней мере, отчасти, задержке поступления кадмия в корни пшеницы и, как следствие, транспорту его ионов в лист.

Не менее важным механизмом металлоустойчивости растений считаются хелатирование токсичных ионов в цитоплазме клетки и изоляция этих комплексов в вакуоль [12]. Как уже отмечалось выше, непротеионовые тиолы (глутатион и фитохелатины) играют в этом процессе важную роль. При этом у более металлоусточивых растений экспрессия генов, контролирующих синтез этих соединений, а также их содержание, как правило, выше, чем у неустойчивых. Но как влияет экзогенный МЖ на синтез глутатиона и фитохелатинов, не известно.

Нами впервые показано, что предобработка растений пшеницы экзогенным МЖ приводит к повышению (почти двукратному) уровня транскриптов генов GS1 и PCS1 в их листьях еще до начала воздействия кадмия (рис. 1). Спустя 1 сут экспозиции проростков на растворе с металлом уровень транскриптов обоих генов в листьях резко возрастал, причем в большей степени у обработанных МЖ растений. В дальнейшем по мере увеличения экспозиции, уровень транскриптов гена GS1 в листьях необработанных растений оставался практически неизменным, тогда как у обработанных проростков продолжал увеличиваться, достигая максимальных значений через 7 сут (рис. 1а). В отличие от этого уровень транскриптов гена PCS1 возрастал как у обработанных, так и у необработанных проростков, причем примерно в равной степени (рис. 1б).

Рис. 1.

Влияние сульфата кадмия (100 мкМ) на уровень транскриптов генов TaGS1 (а) и TaPCS1 (б) в листьях, обработанных экзогенным МЖ (1 мкМ), и необработанных растений пшеницы сорта Московская 39. За единицу принят уровень транскриптов генов в листьях контрольных растений.

Полученные данные свидетельствуют о том, что обработка растений экзогенным МЖ усиливает уровень транскриптов генов, кодирующих ферменты синтеза глутатиона и фитохелатинов, что в дальнейшем при воздействии кадмия обеспечивает лучшую их активацию в клетках, по сравнению с необработанными растениями, и, как следствие, более высокую устойчивость проростков к металлу.

Увеличение содержания глутатиона и усиление экспрессии генов, участвующих в его синтезе, может быть связано с тем, что, помимо детоксикации металлов, глутатион имеет целый ряд других важных функций в растительной клетке, в том числе участвует в поддержании на определенном уровне окислительно-восстановительного баланса [6, 12]. Чем вызвано увеличение экспрессии гена фитохелатинсинтазы у обработанных МЖ растений в отсутствие кадмия в корнеобитаемой среде, пока не вполне ясно. Однако следует иметь в виду, что МЖ, помимо прочего, может выступать в качестве сигнальной молекулы, способной запускать каскад сигнальных реакций [3], благодаря которым обеспечивается более быстрая реакция растений на последующее стрессовое воздействие. Наконец, возможно, что МЖ влияет на метаболизм серы (предшественника глутатиона) [7, 9], также способствуя повышению содержания непротеиновых тиолов.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами впервые установлено, что обработка растений пшеницы экзогенным МЖ усиливает в листьях экспрессию генов, участвующих в биосинтезе глутатиона и фитохелатинов, причем не только в присутствии в корнеобитаемой среде кадмия, но и без него. Более высокий уровень экспрессии генов указанных непротеиновых тиолов в растениях, обработанных МЖ, и меньшее содержание в них кадмия, возможно, и является одной из главных причин их более высокой устойчивости к данному металлу.