Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 512, № 1, стр. 449-453

Магнитные наночастицы (МНЧ) оксидов железа в течение последних десятилетий широко применяются в исследованиях, направленных на создание функциональных материалов биомедицинского назначения: материалов для адресной доставки лекарственных веществ, магнитной гипертермии, магнитной сепарации, магнитно-резонансной томографии и др. [1, 2]. Способность МНЧ в физиологических условиях катализировать образование активных форм кислорода (АФК) и обеспечивать ферроптоз клеток используется для подавления роста опухолей [3]. В то же время вопрос применения МНЧ тесно связан с анализом особенностей их токсического воздействия на организм [4–6]. Известно, что физиологическую совместимость и функциональность систем на основе МНЧ могут обеспечивать белковые покрытия. Среди белков, наиболее часто входящих в состав покрытия, стоит выделить сывороточный альбумин (бычий и человеческий) [7], а также иммуноглобулины G, обеспечивающие возможность нацеливания наночастиц на биологические мишени по механизму “антиген-антитело” in vivo [8] и применяющиеся в различных аспектах иммуносорбции, биохимических анализов и т.д. [2]. Наряду с альбумином, имеющим высокое содержание в плазме крови, иммуноглобулины G (8–12 мг/мл в крови) могут участвовать в формировании “белковой короны” на частицах при их введении in vivo [9]. Также в настоящее время интерес исследователей привлекает гемоглобин, как белок, с которым частицы могут взаимодействовать при гемолизе [10] и способный в виде конъюгатов с альбумином к обеспечению транспорта кислорода [11]. Вопрос о влиянии белков крови на генерацию АФК, катализируемую поверхностью наночастиц оксидов железа, на сегодняшний день мало изучен, а количество исследований в этой области ограничено [12].

Целью настоящей работы является определение закономерностей влияния белков крови на генерацию гидроксильных радикалов при распаде пероксида водорода, катализируемую поверхностью МНЧ в среде с рН, близкими к нейтральным. Генерацию радикалов контролировали с помощью процесса окисления о-фенилендиамина (о-ФДА), приводящего к образованию продукта 2,3-диаминофеназина (окФДА) с максимумом поглощения при 415–455 нм [13, 14].

В работе использовали МНЧ оксидов железа, синтезированные и электростатически стабилизированные по описанной ранее методике [15]. Частицы, имеющие наибольший вклад в объемное распределение частиц по размерам, полученное методом динамического светорассеяния (ДСР), определенного на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern, Великобритания), характеризовались эффективными диаметрами 38–44 нм. Расчетная исходная массовая концентрация МНЧ в золе составляла 40 мг/мл, мольная концентрация магнитных частиц – около 1.33 × 10^–3 мМ [16]. Золи разбавляли водой непосредственно перед экспериментом. После разбавления золя детектируемые методом ДСР размеры частиц сохранялись неизменными не менее 24 ч. o-Фенилендиамин (о-ФДА) (P9029, Sigma-Aldrich), пероксид водорода (95321, Sigma-Aldrich), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) (A1653, Sigma-Aldrich), пероксидазу хрена (HRP) (3329.00001, Диаэм, Россия) и гемоглобин (Hb) (ГМ-4, НПО “Ренам”, Россия) использовали без предварительной очистки. Иммуноглобулин G (IgG) (НПО “Микроген”, Россия) подвергали очистке, как описано в [17]. Перед добавлением пероксида водорода и о-ФДА в исследуемые образцы (содержащие МНЧ и/или белки) образцы инкубировались в течение 30 мин. Значение pH в реакционных системах было постоянным в диапазоне 6.7 ± 0.2. Измерения оптической плотности (OD) исследуемых растворов проводились на спектрофотометре SPECTROstar NANO (BMG, Германия) при 37°C на длине волны (λ_max = 418 нм). Скорость образования 2,3-диаминофеназина (окФДА), V [М/с], которая пропорциональна скорости генерации гидроксильных радикалов, была определена по тангенсу угла наклона начального участка изменения OD с использованием коэффициента экстинкции 13 000 М^–1 × см^–1, представленного в работе [18]. Значение скоростей определялось как минимум в трех независимых экспериментах.

Одним из объяснений способности к генерации гидроксильных радикалов магнитными наночастицами является наличие на их поверхности остаточных ионов Fe²⁺ и Fe³⁺ [19]. На рис. 1 представлена зависимость скорости образования окФДА от концентрации МНЧ (кривая 1) в растворе. При высоких концентрациях МНЧ данная зависимость перестает быть линейной, что, по-видимому, обусловлено агломерацией наночастиц в растворе. На рис. 1, также, представлена зависимость скорости образования окФДА от концентрации пероксидазы хрена (кривая 2). Отметим, что скорость генерации гидроксильных радикалов пероксидазой хрена заметно ниже, чем магнитными наночастицами (например, при концентрациях менее 3 нМ – ниже более, чем на порядок). Данный результат возможен вследствие наличия на поверхности наночастицы некоторого количества ионов железа, способных катализировать образование гидроксильных радикалов, тогда как молекула пероксидазы хрена имеет только один ион железа.

Рис. 1.

Зависимость скорости образования 2,3-диаминофеназина (окФДА) от концентрации магнитных наночастиц (1) и пероксидазы хрена (2). [H₂O₂] = 9.8 мМ, [о-ФДА] = 0.075 мМ, температура 37°С.

При добавлении к исследуемому раствору (о-ФДА, МНЧ, Н₂О₂) альбумина или иммуноглобулина G наблюдается понижение скорости V (рис. 2), связанное, на наш взгляд, с уменьшением детектируемой пероксидазоподобной активности МНЧ. Полученный результат может объясняться одним или несколькими явлениями: (1) перехватом гидроксильных радикалов, генерируемых на поверхности МНЧ из пероксида водорода, молекулами белка; (2) взаимодействием белков с молекулами о-ФДА и/или окФДА, влияющим на окислительную реакцию; (3) экранированием поверхности МНЧ адсорбированными молекулами белка.

Рис. 2.

Зависимость скорости образования окФДА от мольной концентрации альбумина (1) и иммуно-глобулина G (2). [МНЧ] = 0.16 нМ, [H₂O₂] = 9.8 мМ, [о-ФДА] = 0.075 мМ, температура 37°С.

Отметим разницу в зависимостях снижения скорости реакции для разных белков, которая, по-видимому, обусловлена различиями в структуре белков, определяющей особенности их взаимодействия с поверхностью МНЧ, и в их молекулярных массах.

На рис. 3 показана зависимость скорости окисления о-ФДА от концентрации гемоглобина в растворе МНЧ (кривая 1). При концентрациях Hb в образцах, содержащих и не содержащих МНЧ, от 12.5 до 37.0 нМ отмечено увеличение скорости V (рис. 3), связанное, вероятно, со способностью гемового железа в составе гемоглобина катализировать разложение пероксида водорода. При концентрациях Hb ниже 10 нМ и постоянной концентрации МНЧ в растворе не наблюдается роста пероксидазоподобной активности МНЧ в присутствии Hb. Поскольку при концентрациях гемоглобина от 0 до 10 нМ наблюдается рост скорости окисления о-ФДА от концентрации в отсутствии МНЧ в анализируемом образце (рис. 3, кривая 2), а суперпозиция V для МНЧ и Hb при концентрациях белка ниже 12.5 нМ привела бы к зависящему от концентрации Hb приросту V (так, например, при концентрации Hb около 9 нМ можно было бы ожидать около 0.65*108 М/с), которого не происходит для системы, содержащей одновременно МНЧ и Hb, мы предполагаем, что имеет место экранирование поверхности МНЧ молекулами гемоглобина при адсорбции, сопровождаемое снижением их суммарной V до значений, близких к исходным V, характерным для МНЧ. Данное уменьшение скорости обусловлено, на наш взгляд, экранированием поверхности МНЧ молекулами гемоглобина при адсорбции. Хотя отметим, что, как и в случае с ЧСА и IgG, влиять на скорость окисления о-ФДА могут и другие выше перечисленные факторы.

Таким образом, нами впервые определены особенности генерации гидроксильных радикалов, образующихся из пероксида водорода в водных растворах, содержащих магнитные наночастицы (МНЧ), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), иммуноглобулин G (IgG) и гемоглобин (Hb) и получены зависимости скорости образования продукта окисления о-ФДА от концентрации МНЧ в растворе, а также от концентрации белков. Установлено, что в присутствии всех белков (ЧСА, IgG и Hb) пероксидазоподобная активность МНЧ уменьшается, причем добавление Hb в реакционную смесь приводит к снижению или увеличению детектируемой генерации радикалов в зависимости от количества белка.

Рис. 3.

Зависимость скорости образования окФДА от концентрации гемоглобина в присутствии магнитных наночастиц (1) и их отсутствии (2). [МНЧ] = =  0.16 нМ, [H₂O₂] = 9.8 мМ, [о-ФДА] = 0.075 мМ, температура 37°С.

В заключение отметим, что выявленный нами эффект экранирования белками поверхности МНЧ (в случае сывороточного альбумина, иммуноглобулина G) и, вследствие этого, снижения активности частиц в реакциях генерации гидроксильных радикалов, может иметь место при создании гибридных белок-содержащих покрытий на МНЧ для тераностики опухолей, а также вследствие адсорбции белков на МНЧ при введении МНЧ in vivo, что будет приводить к снижению потенциальной токсичности гибридных материалов на основе МНЧ при их циркуляции по кровотоку. Как при создании покрытий, так и при оценке потенциальной токсичности материалов влияние белков на пероксидазоподобную активность МНЧ определяется структурой этих белков, а дальнейшее изучение активности поверхности МНЧ в присутствии низких концентраций белков может представлять особый интерес, будучи связанным с особенностями формирования адсорбционного слоя из молекул этих белков на поверхности МНЧ.

В случае гемоглобина, как мы предполагаем, требуется дополнительное исследование возможности повышения способности МНЧ катализировать генерацию АФК вследствие адсорбции на их поверхности различных количеств гемоглобина.