Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 512, № 1, стр. 422-427

ДНК-полимераза λ (Polλ) относится к структурному Х-семейству, как и ДНК-полимераза β (Polβ) – основная полимераза в системе эксцизионной репарации оснований (BER). Оба фермента обладают активностями, необходимыми для репаративного синтеза: катализируют синтез ДНК в бреши, в том числе на поврежденных матрицах, обладают 5'-dRP-лиазной активностью, а также способны вести синтез с вытеснением цепи [1, 2]. Polβ признана центральной в процессе заполнения однонуклеотидной бреши, возникающей в процессе BER, тогда как роль Polλ в этом процессе остается не до конца выясненной.

Исправление повреждений ДНК в процессе BER происходит в несколько стадий, на каждой из которых под действием определенных ферментов формируются специфические ДНК-интермедиаты. Важную роль в процессе играет координация действия ферментов на каждой стадии за счет взаимодействий с белками-партнерами, регулирующими их активность [3]. Один из ключевых белков-регуляторов репарации ДНК – поли(ADP-рибоза)полимераза 1 (PARP1) – при взаимодействии с поврежденной ДНК катализирует синтез полимера ADP-рибозы, используя в качестве субстрата NAD⁺. Ранее мы показали, что PARP1 модулирует активность Polβ на ДНК-интермедиатах коротко- и длиннозаплаточного путей BER [4]. С другой стороны, в присутствии ДНК-структур, содержащих однонуклеотидную брешь или ник, моделирующих интермедиаты BER на стадии ресинтеза ДНК, наблюдается стимуляция активности PARP1 репликативным белком A (RPA) [5]. Показано также, что RPA стимулирует активность Polλ, в том числе в процессе синтеза на поврежденной матрице [6]. Оба белка, PARP1 и RPA, присутствуют в клетке в значительных количествах и участвуют во многих процессах, поэтому мы исследовали их влияние на активность Polβ и Polλ, чтобы определить, может ли обнаруженный эффект стимуляции активности PARP1 в присутствии RPA проявляться в процессе репарационного синтеза.

Мы провели сравнительный анализ влияния PARP1 и реакции поли(ADP-рибозил)илирования на активность Polβ и Polλ в коротко- и длиннозаплаточных путях BER. Радиоактивно меченный ДНК-дуплекс, содержащий однонуклеотидную брешь с 5′-фосфатом (gap1-p-ДНК) инкубировали с ДНК-полимеразой и dNTP в различных концентрациях, при которых происходило встраивание одного нуклеотида либо наблюдался синтез ДНК с вытеснением цепи (рис. 1). Аналогичным образом проводили реакции в присутствии PARP1 и/или RPA, в отсутствие или в присутствии NAD⁺. Проведенный анализ показал, что PARP1 ингибирует активность обеих ДНК-полимераз, однако ингибирующий эффект зависит как от ДНК-полимеразы, так и от ее концентрации.

Рис. 1.

Влияние PARP1, синтеза поли(ADP-рибозы), RPA и совместного присутствия PARP1 и RPA на активность ДНК-полимераз β и λ в реакции застраивания однонуклеотидной бреши и синтеза с вытеснением цепи. Анализ продуктов реакции в денатурирующем 10%‑м ПААГ. Радиоактивно меченный (по 5’-концу праймера) ДНК-дуплекс (20 нМ), содержащий однонуклеотидную брешь с 5'-фосфатом (gap1-p-ДНК), инкубировали с ДНК-полимеразой и dNTP в указанных концентрациях при 25°С в течение 30 мин в присутствии PARP1 и/или RPA, в отсутствие или в присутствии NAD⁺ (как обозначено на рисунке). Все реакционные смеси содержали 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5 (25°C), 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂ и 50 мкг/мл БСА.

Для Polβ в условиях встраивания одного нуклеотида наблюдалось практически полное ингибирование реакции (рис. 1, дор. 5), тогда как при более высокой концентрации ДНК-полимеразы белок PARP1 подавлял только синтез с вытеснением цепи и практически не влиял на встраивание первого нуклеотида (рис. 1, дор. 12). В случае Polλ наблюдалось практически полное ингибирование не только синтеза с вытеснением цепи, но и включения нуклеотида в брешь (рис. 1, дор. 19 и 26). Следует отметить, что Polλ существенно менее эффективна в реакции синтеза с вытеснением цепи, чем Polβ (рис. 1, сравнить дор. 9, 10 и 23, 24), как было показано ранее [7, 8]. В присутствии NAD⁺ ингибирующий эффект PARP1 значительно снижался, особенно в случае реакции заполнения бреши, катализируемой Polλ (дор. 21). Добавление в реакционные смеси RPA также приводило к разным эффектам – при низкой концентрации ДНК-полимераз RPA стимулировал их активность (рис. 1, дор. 4 и 18), а при высокой – ингибировал, в большей степени через влияние на встраивание первого нуклеотида, чем на синтез с вытеснением цепи (рис. 1, дор. 11 и 25). При совместном добавлении PARP1 и RPA, даже в условиях встраивания одного нуклеотида RPA не только не снимал ингибирующий эффект PARP1, но даже умеренно его усиливал, как в отсутствие (рис. 1, дор. 6, 13, 20, 27), так и в присутствии NAD⁺ (рис. 1, дор. 8, 15, 22, 29). Таким образом, активность Polβ и Polλ может модулироваться белками PARP1 и RPA в зависимости от соотношения концентраций этих белков. Однако влияние стимуляции PARP1 в присутствии RPA на активность ДНК-полимераз в явном виде в наших экспериментах не проявилось.

Основное отличие исследуемых ДНК-полимераз заключается в наличии в структуре Polλ протяженного некаталитического N-концевого участка, включающего BRCT-домен и серин/пролин-богатую область (рис. 2a). С одной стороны, эти домены влияют на каталитическую активность фермента, а с другой – могут участвовать в белок-белковых взаимодействиях с другими факторами репарации и подвергаться посттрансляционным модификациям [9–11]. Возможно, разница во влиянии PARP1 на активности Polβ и Polλ вызвана в том числе взаимодействием этого белка с некаталитическим участком Polλ. В связи с этим была получена мутантная форма Polλ∆N, содержащая только каталитический β-подобный домен (удалены 244 аминокислоты с N-конца) [12, 13]. Следует отметить, что удаление некаталитического участка привело к увеличению активности фермента в реакции заполнения бреши в gap1-p-ДНК практически до уровня Polβ (рис. 2, сравнить панели б и г). Эффективность синтеза с вытеснением цепи, катализируемого Polλ∆N, также значительно увеличилась по сравнению с полноразмерной Polλ. Как видно из диаграмм, представленных на рис. 2, влияние PARP1 и RPA на активность Polλ∆N в большей степени совпадает с характером влияния этих белков на Polβ, чем на Polλ. Таким образом, некаталитические домены Polλ влияют не только на активность фермента, но и на регуляцию этой активности.

Рис. 2.

Влияние PARP1, синтеза поли(ADP-рибозы), RPA и совместного присутствия PARP1 и RPA на активность ДНК-полимераз β, λ и λΔN в реакции застраивания однонуклеотидной бреши и синтеза с вытеснением цепи. (а) Схематическое изображение доменной структуры Polβ, Polλ и Polλ∆N. BRCT-домен – С-концевой домен BRCA1. (б, в и г) Доля удлиненного праймера, определенная как отношение интенсивности продуктов реакции к интенсивности исходного праймера, для реакции, катализируемой Polβ, Polλ и PolλΔN соответственно. Радиоактивно меченный (по 5’-концу праймера) ДНК-дуплекс (20 нМ), содержащий однонуклеотидную брешь с 5′-фосфатом (gap1-p-ДНК), инкубировали с ДНК-полимеразой и dNTP в указанных концентрациях при 25°С в течение 30 мин в присутствии 200 нМ PARP1 и/или 200 нМ RPA, в отсутствие или в присутствии 0.5 мМ NAD⁺ (как обозначено на рисунке). Все реакционные смеси содержали 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5 (25°C), 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂ и 50 мкг/мл БСА.

Далее было проведено сравнение эффективности поли(ADP-рибозил)ирования исследуемых ДНК-полимераз в присутствии gap1-p-ДНК. Выявлено, что Polλ в сравнении с Polβ является менее эффективной мишенью для модификации (следили за уменьшением количества немодифицированной ДНК-полимеразы при увеличении концентрации NAD⁺). Удаление некаталитического участка приводит к увеличению эффективности модификации – уровень модификации Polλ∆N практически не отличается от уровня модификации Polβ (рис. 3). Присоединение отрицательно заряженной поли(ADP-рибозы) значительно ослабляет связывание белков с ДНК, уменьшая эффективную концентрацию ДНК-полимераз. Можно предположить, что именно этот эффект приводит к существенному ослаблению эффективности синтеза с вытеснением цепи для всех ДНК-полимераз в условиях синтеза поли(ADP-рибозы).

Рис. 3.

Сравнение эффективности поли(ADP-рибозил)ирования ДНК-полимераз β, λ и λ∆N. Анализ продуктов поли(ADP-рибозил)ирования Polβ, Polλ и Polλ∆N в денатурирующем 12.5%-м SDS-ПААГ после окрашивания Кумасси R250 (а) и зависимость доли немодифицированных ДНК-полимераз (отношение интенсивности полос в геле (а), соответствующих немодифицированной ДНК-полимеразе в присутствии и в отсутствие NAD⁺) от концентрации NAD⁺ (б). 200 нМ PARP1 инкубировали с 500 нМ ДНК-полимеразой в присутствии 20 нМ ДНК-дуплекса, содержащего однонуклеотидную брешь с 5'-фосфатом (gap1-p-ДНК), и 1 мкМ dNTP при 25°С в течение 30 мин в отсутствие или в присутствии NAD⁺ в указанных концентрациях (как обозначено на рисунке). Все реакционные смеси содержали 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5 (25°C), 50 мМ NaCl, 50 мкг/мл БСА и 5 мМ MgCl₂.

Отличия во влиянии PARP1 на ДНК-полимеразы могут быть также обусловлены белок-белковыми взаимодействиями. Взаимодействие Polβ и PARP1 показано ранее [4, 14, 15], тогда как для Polλ такие исследования не проводились. Предполагалось, что наличие BRCT-доменов в структурах Polλ и PARP1 может внести значительный вклад во взаимодействие между этими белками. Был получен препарат флуоресцентно меченной по N-концевой аминогруппе PARP1 (Cy3-PARP1) и оценено взаимодействие этого белка с ДНК-полимеразами методом флуоресцентного титрования. Результаты измерений показали, что эффективности взаимодействия Polβ и Polλ∆N с PARP1 сопоставимы и практически в два раза выше по сравнению с полноразмерной Polλ (рис. 4), что, с одной стороны, согласуется с эффективностью поли(ADP-рибозил)ирования ДНК-полимераз, а с другой – указывает на возможные взаимодействия PARP1 и ДНК-полимераз на ДНК. Однако обнаруженная разница все же недостаточна, чтобы однозначно сделать вывод о том, участвует ли некаталитический участок Polλ в связывании с PARP1, или связывание осуществляется преимущественно за счет β-подобного домена. Кроме того, следует иметь в виду, что Polβ и Polλ∆N не являются полностью идентичными, и их каталитические домены могут по-разному взаимодействовать с PARP1 и другими факторами репарации.

Рис. 4.

Сравнение эффективности связывания PARP1 c ДНК-полимеразами β, λ и λ∆N. Кривые титрования флуоресцентно меченной Cy3-PARP1 (10 нМ) Polβ, Polλ и Polλ∆N в возрастающих концентрациях (а) и значения EC₅₀ для комплексов PARP1 с ДНК-полимеразами, рассчитанные с помощью уравнения Хилла (б). Уравнение Хилла: $\theta = {{\theta }_{\infty }}\left[ {1 + {{{({\text{E}}{{{\text{C}}}_{{50}}}{\text{/C)}}}}^{{\text{n}}}}} \right]$ , где θ – относительная интенсивность флуоресценции PARP1 в комплексе с ДНК-полимеразой в концентрации C; θ_∞ – максимальное значение относительной интенсивности флуоресценции PARP1 в комплексе с ДНК-полимеразой (в насыщающих концентрациях), EC₅₀ – концентрация ДНК-полимеразы, при которой θ = θ_∞/2; n – коэффициент Хилла (угол наклона кривой). Относительная интенсивность флуоресценции θ = (f–f₀)/f₀, f и f₀ – интенсивности флуоресценции PARP1 в присутствии и в отсутствие ДНК-полимеразы соответственно. Все реакционные смеси содержали 25 мМ Трис-HCl, pH = 7.5 (25°C), 50 мМ NaCl, 0.5 мМ DTT.

Суммируя полученные данные, мы предполагаем, что в отсутствие NAD⁺ ингибирующий эффект PARP1 на активность Polβ и Polλ вызван преимущественно конкуренцией за ДНК, но при этом за счет белок-белковых взаимодействий с PARP1 ДНК-полимеразы могут удерживаться на ДНК-субстрате, что снижает эффективность ингибирования. При добавлении NAD⁺ PARP1 автополи(ADP-рибозил)ируется и высвобождает ДНК, что приводит к практически полному восстановлению активности ДНК-полимераз, а остаточный ингибирующий эффект объясняется поли(ADP-рибозил)ированием ДНК-полимераз, ослабляющим связывание ДНК-полимераз с ДНК. Влияние PARP1 на активность Polβ и Polλ принципиально схоже, но отличается по силе воздействия. Эта разница обусловлена, по-видимому, наличием в структуре Polλ протяженного некаталитического N-концевого участка. Согласно литературным данным, этот участок не участвует в связывании ДНК напрямую [12], но при этом влияет на сродство полноразмерной ДНК-полимеразы к ДНК. Так, ранее было показано, что сродство Polλ к однонуклеотидной бреши в 3 раза ниже, чем Polβ, 90 нМ и 30 нМ соответственно [16]. Кроме того, наличие этого участка ингибирует белок-белковые взаимодействия между Polλ и PARP1. Как результат, Polλ более “чувствительна” к влиянию PARP1, чем Polβ, поскольку менее эффективно конкурирует с PARP1 за ДНК-субстрат и менее эффективно удерживается на ДНК за счет взаимодействия с PARP1.

Таким образом, некаталитические домены Polλ играют супрессорную роль как по отношению к полимеразной активности фермента, так и во взаимодействии с ДНК и PARP1. Это может быть одной из причин ключевой роли Polβ в BER в сравнении с Polλ [17].