Экология, 2021, № 4, стр. 254-262

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Методика включала последовательное решение задач по отбору образцов почвы различного типа, их физико-химическому анализу, подбору доз загрязнения нефтью, постановке токсикологических экспериментов с гетеротрофными бактериями, одноклеточными водорослями, сосудистыми растениями и низшими ракообразными. Затем определяли интегральную чувствительность исследуемых почв к нефтяному загрязнению.

Район отбора и анализ почвенных образцов. Поскольку для Пермского края характерно большое разнообразие почв [8], образцы дерново-подзолистой, дерново-карбонатной, светло-серой, темно-серой и пойменной почв отбирали в юго-восточных районах края (табл. 1) из верхних горизонтов (U1/А1) с глубины 0–20 см. Физико-химические свойства и агрохимические показатели (C_орг, гумус, NPK) почв определяли с помощью общепринятых в почвоведении методов.

Внесение нефти и определение ее содержания в почве и водных вытяжках. Для экспериментального загрязнения отобранных почв в лабораторных условиях использовали нефть (ρ = 872.0 кг/м³; концентрация хлористых солей 303.5 мг/дм³; серы 2.2%) из Соловатовского месторождения, которую вносили в концентрации 1, 2, 3 и 5 г/кг почвы, а при микробиологических исследованиях ряд был продолжен повышенными концентрациями – 100 и 300 г/кг.

Содержание нефтепродуктов в почве и водных вытяжках из нее определяли гравиметрическим методом [9, 10]. Использовали методику теплой хлороформенной экстракции общего битумоида, осуществляемой с помощью лабораторной системы экстракции Buchi B-811 (Швейцария) в режиме “Soxhlet Warm – теплый Сокслет”. Остаточное содержание нефтепродуктов рассчитывали по разнице концентраций хлороформенного битумоида в нефтезагрязненной и контрольной (без внесения нефти) почвах и соответствующих водных вытяжках.

Для определения численности и морфологического разнообразия гетеротрофных почвенных бактерий использовали чашечный метод Коха. Посев серийных 10-кратных разведений водных суспензий почвенных образцов проводили согласно [12] на элективную для данной эколого-трофической группы среду LB [13] через 48 ч после загрязнения почвы нефтью. Культивирование проводили в термостате ТС-1/20 СПУ при 28°С в течение 5–14 сут. Морфологическое разнообразие бактериальных колоний описывали согласно [12].

Фитотоксичность почвы в отношении сосудистых растений. Вегетационный хронический эксперимент проводили согласно стандартной методике определения фитотоксичности почвы [11]. В качестве тест-культур для определения степени уязвимости сельскохозяйственных почв использовали кресс-салат посевной (Lepidium sativum L.) и пшеницу мягкую (Triticum aestivum L.), а ель сибирскую (Picea obovata Ledeb.) и сосну обыкновенную (Pinus sylvestris L.) – для почв лесного фонда. Растения выращивали в течение 14 сут при стандартных условиях [11]. Всхожесть семян составляла не менее 95%.

В качестве наиболее чувствительного критерия фитотоксического действия нефтезагрязнения использовали изменение длины корней проростков на 20% и более относительно контрольных вариантов. Для этого определяли действующие концентрации (ДК) нефтепродуктов в почве, приводящие к 20%-ному (ДК₂₀) снижению измеренных параметров тест-культур.

Токсичность водных вытяжек из почвы для гидробионтов. Влияние водных вытяжек из нефтезагрязненных почв на жизнеспособность гидробионтов определяли в остром токсикологическом опыте с использованием тест-культур микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer [14] и низших ракообразных Daphnia magna Straus [15]. В качестве контролей применяли водные вытяжки из чистых почв. Выращивание хлореллы проводили на 10%-ной среде Тамия в многокюветном культиваторе водорослей, оснащенном измерителем оптической плотности (ОП) суспензии непосредственно в кюветах. Токсичность вытяжек оценивали по снижению на 20% и более (подавление роста) или увеличению на 30% и более (стимуляция роста) величины ОП культуры водоросли после 22 ч роста.

Культуру дафний выращивали в климатостатах в контролируемых условиях среды [15], биотестирование проводили с помощью устройства для экспонирования, оценивая острую токсичность водных вытяжек из почв по уровню смертности рачков. Количество живых и мертвых особей определяли методом прямого счета. Критерием острой токсичности служила гибель 50% и более дафний за 48 ч.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью свободного программного обеспечения RStudio. Для представления данных использовали средние значения и ошибки среднего (m ± SE). Для оценки взаимосвязи между концентрацией нефти в почве и исследуемыми переменными применяли коэффициент линейной корреляции Пирсона (где r – коэффициент корреляции и p – статистическая значимость). Средние значения результатов параллельных измерений использовали в качестве учетных единиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика почв. В работе использована не насыщенная основаниями дерново-подзолистая почва, которая отличалась тяжелосуглинистым гранулометрическим составом, кислой реакцией, пониженной обеспеченностью гумусом и элементами питания растений (табл. 1). Дерново-карбонатная почва характеризовалась повышенным содержанием гумуса, слабощелочной реакций среды, преобладанием в поглощающем комплексе Са и Мg, высокой емкостью катионного обмена (ЕКО) и относительно низким содержанием подвижного Р₂О₅. Насыщенная основаниями светло-серая лесная почва отличалась средним содержанием гумуса, низким уровнем обеспеченности подвижным P, имела среднюю обеспеченность подвижным K и слабокислую реакцию, а темно-серая лесная почва при слабокислой реакции среды – рекордно высоким содержанием гумуса и самыми высокими среди исследованных почв показателями содержания подвижного N, P и K, не насыщена основаниями, имеет высокую ЕКО. Пойменная почва, формирующаяся в условиях регулярного затопления паводковыми водами, имела резко кислую реакцию среды, низкое содержание гумуса и сравнительно низкую обеспеченность элементами питания, а также средние показатели ЕКО.

Результаты определения остаточного содержания нефтепродуктов в исследованных почвах показали, что контрольные образцы почв (без внесения нефти) характеризовались фоновым содержанием общего битумоида на уровне 0.4−0.8 г/кг сухой почвы, при этом для пойменной почвы был зарегистрирован наиболее высокий (1.7 г/кг почвы) фоновый уровень содержания природных углеводородов (табл. 2).

Гетеротрофные почвенные бактерии. Оценка влияния нефтяного загрязнения на численность гетеротрофных почвенных бактерий свидетельствовала об усилении их развития в присутствии низких (до 5 г/кг почвы) концентраций нефти (табл. 3). При этом численность гетеротрофов в дерново-подзолистой, темно-серой и пойменной почвах повышалась в 2−10 раз по сравнению с контролем. Высокие концентрации нефти (100 и 300 г/кг почвы), характерные для аварийных нефтеразливов, напротив, угнетали почвенный бактериоценоз, что наиболее сильно (>400-кратное снижение численности бактерий) проявлялось в дерново-карбонатной и светло-серой почвах.

Анализ морфологического разнообразия показал, что нефтяное загрязнение во всем диапазоне концентраций приводило к снижению биоразнообразия гетеротрофных бактерий (см. табл. 3). Наиболее сильная обратная зависимость (r = –0.96) данного признака от концентрации нефти выявлена в отношении дерново-подзолистой почвы, а наиболее слабая (r = –0.55) – темно-серой. Таким образом, показатель биоразнообразия является, очевидно, чувствительным критерием степени нарушенности почвенной экосистемы под воздействием нефтяного загрязнения.

Высшие сосудистые растения. Анализ результатов вегетационного хронического эксперимента выявил обратную зависимость между длиной корней высших растений и содержанием нефтепродуктов в почве (табл. 4). Самая сильная обратная корреляция установлена в отношении кресс-салата (от r = –0.92 до r = –0.98) и ели (от r = –0.91 до r = –0.98), что свидетельствует о высокой информативности результатов биотестирования с использованием данных тест-культур. При этом проростки ели отличались максимальной чувствительностью к внесению нефти в почву (ДК₂₀ = 2.1–3.3 г/кг), тогда как проростки сосны неоднозначно реагировали на нефтезагрязнение (значения ДК₂₀ колебались от 3.2 до 17.3 г/кг). Более устойчивыми по сравнению с елью оказались сельскохозяйственные культуры (значения ДК₂₀ составляли 2.3−3.9 и 2.9−4.2 г/кг для кресс-салата и пшеницы соответственно).

Обнаружено сходство показателей фитотоксичности нефтезагрязненных почв в отношении разных тест-культур. Так, ингибирование роста корней практически всех использованных в работе видов растений было максимальным при нефтезагрязнении дерново-подзолистой почвы, что коррелировало с низким содержанием в ней органического углерода и гумуса (см. табл. 1). В то же время выявленная при фитотестировании относительная устойчивость пойменной почвы к нефтяному загрязнению (в 1.1−1.9 раз выше других почв) согласуется с высоким фоновым содержанием в ней углеводородных компонентов (см. табл. 2).

Токсичность водных вытяжек из почв. Возможное влияние нефтяного загрязнения почвы на сопредельную водную среду определяли по токсичности водных вытяжек из нефтезагрязненной почвы для гидробионтов. Как видно из табл. 5, вытяжки из образцов всех исследованных почв, включая контрольные, содержали нефтепродукты в очень низкой (0.065−0.27 мг/л) концентрации. Не выявлено строгой корреляции между количеством битумоида, выделенного хлороформной экстракцией из водной фазы, и концентрацией внесенной в почву нефти. Также не выявлено достоверных различий по содержанию битумоида в водных вытяжках из почв различного типа.

Результаты биотестирования водных вытяжек с использованием микроскопических водорослей Chlorella vulgaris показали (табл. 6) достоверное увеличение (в 1.4−2.6 раза) плотности культуры в присутствии неразбавленных вытяжек из чистых почв и более выраженное (в 2.0−3.5 раза) стимулирование роста клеток неразбавленными вытяжками из почв с максимальным (5 г/кг почвы) уровнем нефтяного загрязнения. Пропорциональное снижение оптической плотности культуры при разбавлении вытяжек из нефтезагрязненных почв указывало на возможный дозозависимый характер стимулирующего эффекта, поэтому расчет пороговой концентрации (ДК₃₀) выполнен по уравнениям линейной регрессии между содержанием нефти в почве и ростом культуры водорослей.

При биотестировании почвенных вытяжек, как контрольных, так и с разным уровнем нефтезагрязнения, на тест-культуре Daphnia magna погибших особей выявлено не было, что указывало на отсутствие острого токсического воздействия. Следовательно, дафниевый тест не пригоден для биотестирования почвы с низким уровнем нефтяного загрязнения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Влияние нефтяного загрязнения на гетеротрофные почвенные бактерии. Важным критерием экологического состояния почвы на загрязненной территории является динамика численности почвенного бактериоценоза, в частности гетеротрофной эколого-трофической группы аэробных бактерий [3, 7, 20].

Низкие (1−5 г/кг почвы) концентрации нефти оказывали нейтральное или стимулирующее воздействие на численность гетеротрофных бактерий использованных в работе почв (за исключением дерново-карбонатной). При высоком уровне нефтезагрязнения (100 и 300 г/кг почвы) наблюдалось подавление численности гетеротрофов в трех из пяти исследованных почвах. Многие исследователи также отмечают сложный нелинейный характер динамики общей численности почвенной микробиоты при низком уровне нефтяного загрязнения стимулирование роста углеводородокисляющих бактерий или отсутствие выраженного общетоксического эффекта [2, 3].

Наиболее чувствительным и информативным показателем неблагополучного состояния почвенного микробиоценоза служит изменение качественного состава популяции, отражающее перераспределение доминантных форм, быстро адаптирующихся к условиям загрязнения.

С использованием простого метода учета различных по морфологии бактериальных колоний, выросших на агаризованной среде LB, нами выявлена четкая обратная корреляция между показателем разнообразия гетеротрофных бактерий и концентрацией нефти в исследованных почвах. При этом в диапазоне концентраций нефти 1−5 г/кг почвы коэффициенты корреляции составили от –0.68 для дерново-карбонатной до –0.96 для пойменной почвы.

Первоочередной реакцией почвенного бактериоценоза в ответ на нефтяное загрязнение, очевидно, является снижение видового разнообразия и перераспределение трофических групп, в частности от фототрофов (цианобактерий) и азотфиксаторов (Azotobacter) к углеводородокисляющим фирмикутам, протеобактериям и актинобактериям [3, 20]. Однако в хронически загрязненных углеводородами почвах и при проведении долгосрочных работ по биоремедиации часто происходит формирование специализированных микробных сообществ нефтедеструкторов, характеризующихся даже более высоким видовым разнообразием, чем соответствующие “чистые” почвы [21]. В этом случае надежными биоиндикаторами служат представители отдельных таксонов, например актинобактерий рода Rhodococcus (R. ruber, R. apacus, R. erythropolis), количественно определяемых в нефтезагрязненной почве прямой ПЦР-детекцией [22].

Реакция тест-культур высших растений на нефтяное загрязнение почв. Лесные экосистемы часто испытывают наиболее существенное негативное воздействие нефтяного загрязнения почвы. Наиболее чувствительны к токсичному воздействию нефти хвойные древесные растения на ранних этапах развития [16]. По нашим данным, проростки ели отличались самой высокой чувствительностью к нефтезагрязнению, о чем свидетельствовали минимальные (ДК₂₀ = 2.1−3.3 г/кг) величины действующей концентрации нефти, приводящие к 20%-ному уменьшению длины корней. Более высокая устойчивость, в зависимости от типа почвы, выявлена у сосны, что согласуется с ранее опубликованными данными [16] о влиянии нефтезагрязненной воды на прорастание семян хвойных пород. Учитывая сильную обратную корреляцию (от –0.91 до –0.98) между концентрацией нефти и длиной корней проростков, ель может быть рекомендована в качестве чувствительной и надежной тест-культуры для биотестирования почв лесных зон, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Представление о том, что лесные экосистемы могут загрязняться в большей степени, чем сельскохозяйственные [17], не подтверждается экспериментальными данными. Так, исследованные нами сельскохозяйственные культуры – кресс-салат и пшеница – были более устойчивы к нефтезагрязнению всех пяти типов почв, чем основная лесообразующая порода – ель.

По литературным данным, концентрация нефти, вызывающая торможение роста корней кукурузы (Zea mays), составляет 10−11 г/кг почвы [4, 18], фасоли (Phaseolus nipponensis Ohwi) – 10 г/кг [18], пшеницы (Triticum aestivum L.) – 16 г/кг [4], маша (Vigna radiata L.) – 10 г/кг [19]. Следует отметить, что в работах [18, 19] отсутствуют данные о влиянии на растения нефти в концентрации ниже 10 г/кг почвы. Полученные нами более низкие (2−4 г/кг почвы) пороговые концентрации нефти в отношении сельскохозяйственных культур свидетельствуют о недооцененной потенциальной опасности “низкого” уровня нефтезагрязнения и необходимости дальнейшего исследования фитотоксичности нефти в данном диапазоне концентраций с расширением спектра фитокультур и исследуемых почв.

Реакция гидробионтов на нефтяное загрязнение почв. Культуры гидробионтов – зеленой протококковой водоросли Chlorella vulgaris и ветвистоусых пресноводных рачков Daphnia magna – обычно сходным образом реагируют на наличие в воде экотоксиканта [23]. Однако наши результаты определения токсичности водных вытяжек из нефтезагрязненных почв выявили различную реакцию – стимулирование роста водорослей и отсутствие изменений числа жизнеспособных особей дафний при воздействии низких концентраций нефти (1−5 г/кг почвы). Возможно, это связано с пониженной растворимостью нефтяных углеводородов в воде, потерями во время фильтрации, а также их прочной сорбцией органическим веществом почвы. На последнее, в частности, указывают наиболее низкие (0.065−0.135 мг/л) концентрации битумоида в вытяжках из темно-серой лесной почвы, характеризующейся самым высоким содержанием гумуса из исследованных почв (см. табл. 1 и 5).

В литературе встречается чрезвычайно широкий диапазон (от 0.002 до 10 000 мг/л) токсичных концентраций нефти и нефтепродуктов для водорослей и водных растений, включая стимулирующие эффекты нефти при низких концентрациях [24]. В работе [25] сообщается о способности Chlorella vulgaris очищать воду от нефти, при этом доза нефти 20 г/л оказывала стимулирующее воздействие на рост водоросли. Аналогичные результаты получены Romero et al. [26] при исследовании процесса биодеградации нефти в воде культурой Chlorella sp. Наши результаты и данные литературы указывают на ограниченную возможность использования дозозависимого стимулирования культуры хлореллы для определения нижнего порогового уровня нефтезагрязнения почвы.

При оценке острой токсичности нефти в отношении Daphnia magna достоверный токсический эффект отмечен при дозах выше 100 мг/л, а при концентрации 400 мг/л и выше дафнии гибли через 96 ч [27]. В работе [5] при действии на дафний водорастворимых нефтяных фракций гибель 50% особей в течение 48 ч зарегистрирована лишь при уровне загрязнения от 254 до 640 мг/л. Таким образом, результаты наших исследований подтверждают данные о том, что низкие концентрации нефтяных углеводородов безопасны для дафний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментально определенные и рассчитанные на основании полученных результатов показатели чувствительности использованных тест-организмов к воздействию нефтезагрязненных почв сведены в табл. 7 для сравнения и выбора критических параметров при определении максимально допустимых уровней нефтяного загрязнения почв различного типа.

Как видно из табл. 7, фитотоксичность в отношении высших растений – наиболее чувствительный к нефтезагрязнению параметр для всех исследованных почв. В частности, тесты на прорастание кресс-салата посевного и ели сибирской, характеризующиеся высокой чувствительностью результатов, могут использоваться при оценке уязвимости для нефтяного загрязнения почв сельскохозяйственного назначения и лесного фонда соответственно. Показатели разнообразия почвенного бактериоценоза оказались в 2.4−6.4 раза менее чувствительными по сравнению с фитотестом. Однако, учитывая относительную простоту постановки опыта и информативность результатов, используемый нами метод биотестирования, основанный на подсчете морфологически различающихся бактериальных колоний, может быть полезен для экспрессной оценки состояния почвы, свежезагрязненной в результате небольших проливов нефти и нефтепродуктов. Полученные результаты биотестирования с использованием различных гидробионтов свидетельствуют о существенных ограничениях применения данного метода при низком уровне нефтезагрязнения почвы, которые могут частично преодолеваться использованием большего объема взятой для анализа почвы или более чувствительных культур гидробионтов и их физиологических характеристик [28]. При этом установленные по стимулированию роста хлореллы водными вытяжками пороговые уровни концентрации нефти в почве были сопоставимы с данными, полученными при тестировании на высших растениях.

Таким образом, в результате проведенного биотестирования установлена различная реакция использованных тест-культур на воздействие сравнительно низких концентраций нефти в экспериментально загрязненной почве. Выявленные различия определяются не только разным порогом чувствительности организмов к воздействию экотоксиканта, но и такими физико-химическими свойствами почв, как содержание органического углерода и гумуса, фоновый уровень углеводородных компонентов и поглощающая способность почвы в отношении нефтяных углеводородов.

Публикация подготовлена в рамках реализации Программы деятельности научно-образовательного центра мирового уровня “Рациональное недропользование” на 2019−2024 годы (распоряжение Правительства РФ от 30 апреля 2019 г. № 537) и при финансовой поддержке РНФ (грант № 18-14-00140).