Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2021, T. 57, № 5, стр. 402-410

ВВЕДЕНИЕ

Неонатальный и препубертатный (подростковый) периоды относятся к критическим периодам развития, которые характеризуются реорганизацией нейробиологических систем, включая ГГАКС, репродуктивную систему и различные нейротрансмиттерные системы [1–5]. Интенсивно протекающее структурно-функциональное созревание головного мозга в критические периоды определяют повышенную реактивность нервной системы к болевым раздражителям [6, 7]. Боль в раннем возрасте модифицирует в постнатальном онтогенезе не только ноцицепцию [8], но и функциональную активность ГГАКС [9], что в дальнейшем вызывает изменения разных типов поведения [6]. Ранее нами было обнаружено, что очаг воспалительной боли на периферии у новорожденных крысят является фактором риска формирования тревожно-депрессивного состояния, усиления болевого ответа и ухудшения процесса обучения при достижении животными раннего препубертатного периода развития (25–35 дней) [10]. В многочисленных исследованиях показано, что стресс, не связанный с болью, модифицирует развитие ГГАКС, что в дальнейшем проявляется в ухудшении процессов обучения и памяти у взрослых [11, 12], но не известно, на каком этапе развития становятся очевидными последствия именно болевого стресса, нередко встречающегося в неонатальной клинике. Данные литературы позволяют сопоставлять уровень развития головного мозга новорожденного крысенка с уровнем развития головного мозга недоношенного ребенка [13], поэтому в настоящей работе мы использовали одно- и двухсуточных крыс в качестве модели для исследования влияний повторной воспалительной боли у рожденного раньше срока ребенка (модель недоношенной беременности). На основании разных критериев развития нервной системы и поведения у крысы были установлены границы препубертатного периода развития с 21-го по 59-й постнатальный день [14]. Использование разнополых особей способствует изучению механизмов исследуемых явлений. Однако работы преимущественно проводятся только на самцах [15, 16]. Известно, что половое созревание у самок начинается с 35 ± 2-го дня, а у самцов с 42 ± 2-го дня [2], поэтому мы использовали 45–53-дневных крыс (поздний препубертатный период), у которых уже могут проявиться половые различия в когнитивных процессах. В подростковом периоде начинают проявляться последствия негативных воздействий, которые испытал организм в раннем возрасте. Изучение  этих последствий на разнополых особях именно на этом этапе индивидуального развития является важным направлением в исследовании механизмов неврологических и когнитивных нарушений с целью их возможной коррекции и восстановления нормальной жизнедеятельности.

В настоящей работе мы исследовали ранее не изученное влияние воспалительной боли у новорожденных крысят на реактивность ГГАКС, а в позднем препубертатном периоде (45–53 дней) – на процессы пространственного обучения, памяти и на реактивность ГГАКС к стрессу принудительного плавания у самцов и самок крыс.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Работа выполнена на потомстве крыс линии Вистар, полученных из Биоколлекции Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург) и доставленных в виварий лаборатории. Все процедуры работы с животными проводились в соответствии с принципами Базельской декларации; протоколы опытов утверждены комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. В виварии лаборатории взрослые самки и самцы, как и их потомство, содержались в стандартных условиях (свободный доступ к стандартизированной пище и воде, 12:00–12:00 включение и выключение света в 8 ч, 22–23°С). Беременность определяли по мазку из влагалища на следующий день после подсадки. После рождения крысят (P0, постнатальный день) в каждом помете оставляли не более восьми животных. Для определения реактивности ГГАКС у новорожденных крысят в ответ на создание очага воспалительной боли были использованы самки и самцы (по два самца и две самки от каждой матери), рожденные от пятнадцати матерей (эксперимент 1). Крысята в первый день после рождения были подвергнуты подкожной инъекции воспалительного агента формалина (2.5%, 0.5 мкл) в подошву задней конечности (контроль – инъекция физиологического раствора). Через 30 мин после этой процедуры декапитацией собирали кровь у одной группы крысят, у крысят второй группы – через сутки, третьей группы – через семь суток для дальнейшего определения содержания кортикостерона в плазме крови (в каждой экспериментальной и контрольной группе 6–8 крысят). Кровь у новорожденных собирали в одну пробирку от одного самца и одной самки.

Для изучения влияния неонатального болевого воздействия на когнитивные способности и реактивность ГГАКС у крыс, рожденных от 16 матерей, в препубертатный период развития очаг воспалительной боли создавали аналогично вышеописанному в одно- и повторно двухдневном возрасте инъекцией формалина в подошву задней конечности, спинку этих подопытных крысят маркировали (эксперимент 2). Контрольным крысятам инъецировали физиологический раствор в подошву задней конечности в то же место, в том же объеме. Каждая группа состояла из 12–16 животных. Крысят возвращали в гнезда к своим матерям, где они находились до 30-дневного возраста, затем разнополых крыс рассаживали в разные клетки.

С 45-дневного возраста оценивали способность к пространственному обучению нахождения платформы в водном лабиринте Морриса [17, 18]; тренировочные пробы продолжались в течение пяти дней. План обучения каждый день был одинаков для каждого животного: по четыре попытки в первой пробе, перерыв четыре минуты, и четыре попытки во второй пробе; местоположение платформы в бассейне было постоянным. Бассейн был условно разделен на четыре квадранта. В первую попытку крысу помещали в 1-й квадрант бассейна, во вторую – во 2-й, в третью – в 3-й и, наконец, в четвертую попытку – в 4-й квадрант бассейна. В бассейне (диаметр 120 см, высота 72 см), наполненном до 40 см водой (24°С), замутненной мелом, в одном из квадрантов ниже воды на 2 см находилась платформа, которую крыса должна была найти в течение 60 с. На платформе крыса находилась 20 с, во время которых она могла свободно ориентироваться в пространстве по окружающим предметам, затем ее помещали на 15 с в сухую клетку для отдыха. В каждой попытке регистрировали латентный период достижения платформы. На пятый день после первой пробы крыс оставляли в сухой клетке на 1 ч в другом помещении. Затем у этих животных регистрировали кратковременную память, для чего крысу помещали в бассейн без платформы и регистрировали латентный период достижения целевого квадранта, места, где в тренировочных пробах находилась платформа. После регистрации кратковременной памяти крыс вытирали и возвращали в свои клетки. Через 96 ч после регистрации кратковременной памяти регистрировали долговременную память в тех же условиях, что и кратковременную память. Кроме латентного периода нахождения целевого квадранта регистрировали время, в течение которого крыса находилась в целевом квадранте за период времени, равный 60 с. Регистрацию в водном лабиринте Морриса проводили как визуально, так и с помощью вебкамеры и регистрации на компьютере с использованием специальной компьютерной программы.

Определение реактивности ГГАКС у крыс в ответ на принудительное плавание осуществляли через 30 мин после завершения регистрации долговременной памяти. Кровь собирали декапитацией у самцов и самок в разные пробирки, центрифугировали плазму и хранили при –20°С до проведения иммуноферментного анализа (ИФА) на содержание кортикостерона.

Статистический анализ для первой (a) и второй (b) проб, статистические сравнения влияния воздействия, пола и дня тестирования проведены с помощью многофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Факторы: пол (самцы, самки), воздействие (формалин, физиологический раствор) и дни (1, 2, 3, 4, 5) для первой пробы и дни (1, 2, 3, 4) для второй пробы. Влияние воздействия, пола и дня тестирования на пространственную кратковременную и долговременную память проверяли с использованием смешанного дисперсионного анализа ANOVA, факторы: пол (самцы, самки), воздействие (формалин, контроль), латентность (кратковременная/долговременная память), время пребывания в целевом квадранте (кратковременная/долговременная память). Для кортикостерона новорожденных и 53-дневных крыс статистический анализ проведен с использованием двухфакторного дисперсионного анализа. Факторы для новорожденных: время после инъекции формалина: 30 мин, 1 сутки, 7 суток, и воздействие: базальный уровень, физиологический раствор и формалин; факторы для 53-дневных: пол и воздействие: базальный уровень, физиологический раствор и формалин. Парные сравнения между группами проведены с помощью теста Бонферрони.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пространственное обучение. В препубертатный период развития, как у контрольных, так и у подопытных крыс, обнаружена способность к пространственному обучению: латентный период достижения платформы уменьшился к пятому тренировочному дню. Для первой пробы (а) получены значимые главные эффекты для факторов день: F(2.6 152.7) = 122, p < 0.001, η² = 0.678 (Greenhouse-Geisser тест) и воздействие: F(1, 58) = 8, p = 0.007, η² = 0.120. Хотя взаимодействие пола и воздействия не было получено, различия между формалином и контролем проводились отдельно для самцов и самок в целях единообразия представления результатов в первой и второй пробе. Post-hoc анализ показал, что неонатальная воспалительная боль нарушила процесс обучения у самцов, увеличив у них латентность в первой пробе в первый (р = 0.017) и пятый (р = 0.002) тренировочные дни, у самок в третий и четвертый день (p < 0.05, в обоих случаях (рис. 1а).

Рис. 1.

Латентный период достижения платформы в водном лабиринте Морриса в первую пробу – в течение пяти дней (а), и вторую пробу – в течение четырех дней (б), у самцов и самок крыс препубертатного возраста, подвергнутых в новорожденном состоянии воспалительной боли.

По вертикали: латентный период (с), по горизонтали: номера тренировочных дней. В первой пробе уровень значимости: * p < 0.05, ** p < 0.01, различия между формалином и контролем у самцов; ⁺p < 0.05, различия между формалином и контролем у самок. Во второй пробе уровень значимости: * p < 0.05, ** p < 0.01, различия между формалином и контролем у самцов; ^#p < 0.05, ^##p < 0.01 половые различия.

Для второй пробы (b) получены главные эффекты для факторов день: F(1.9 109.7) = 19.4, p < 0.001, η² = 0.250 (Greenhouse-Geisser тест), воздействие: F(1, 58) = 14.7, p < 0.001, η² = 0,202, пол: F(1, 58) = = 12, p = 0.001, η² = 0.172, а также взаимодействие пола и воздействия: F(1, 58) = 4, p = 0.05, η² = 0.062. Post-hoc анализ показал, что неонатальная боль увеличила латентный период у самцов (в первый, третий и четвертый день p = 0.011, p = 0.003 и p = = 0.04 соответственно) (рис. 1b). Половые различия выявлены во второй пробе у крыс с неонатальной болью с более высокой латентностью у самцов (в 1, 3 и 4 день, p = 0.024, p = 0.01 и p = 0.04 соответственно) (рис. 1b).

Пространственная кратковременная и долговременная память. Смешанный дисперсионный анализ ANOVA обнаружил значимый главный эффект только для воздействия во времени пребывания в целевом квадранте (кратковременная/долговременная память) F(1.56) = 6.5, p = 0.013, η² = 0.105. Неонатальная боль не изменила кратковременную память у крыс обоего пола, о чем свидетельствовало отсутствие изменений в латентном периоде достижения целевого квадранта, в котором находилась платформа во время обучения. Парные сравнения по Бонферрони показали, что неонатальная боль вызвала дефицит долговременной памяти только у самцов, у которых латентность увеличилась (р < 0.01) по сравнению с латентностью у контрольных самцов, тогда как у особей женского пола неонатальная боль нивелировала различия в латентности между долговременной и кратковременной памятью, которые были обнаружены у контрольных самок с большей эффективностью осуществления задачи в долговременной памяти (р < 0.05) (рис. 2a).

Рис. 2.

Регистрация кратковременной (a) и долговременной (b) памяти в водном лабиринте Морриса у самцов и самок крыс препубертатного возраста, подвергнутых в новорожденном состоянии воспалительной боли.

По вертикали: латентный период достижения целевого квадранта (с) и время нахождения в целевом квадранте (с). Белые столбики – контроль, темные столбики – формалин. Уровень значимости: * p < 0.05, ** p < 0.01, различия между формалином и контролем у самцов; ^#p < 0.05, различия в латентном периоде достижения целевого квадранта между кратковременной и долговременной памятью у контрольных самок.

При оценке памяти по другому показателю, времени пребывания в целевом квадранте неонатальная боль вызвала дефицит в кратковременной и долговременной памяти у самцов: уменьшение показателя в обоих случаях (р < 0.05) по сравнению с временем пребывания в целевом квадранте у контрольных самцов. Различия в эффективности между кратковременной и долговременной памятью отсутствовали как у контрольных, так и у подопытных крыс (рис. 2b).

Кортикостерон в плазме крови у новорожденных в ответ на боль, вызванную формалином. Здесь получены значимые главные эффекты для обоих факторов и значимо взаимодействие времени и воздействия, F(2.47) = 75.6, p < 0.001, η² = 0.763, F(2.47) = = 26.3, p < 0.001, η² = 0.528 и F(4.47) = 9.7, p < 0.001, η² = 0.451, время и воздействие соответственно. Post-hoc анализ показал, что содержание кортикостерона в плазме крови в ответ на воспалительную боль в новорожденном возрасте увеличилось через 30 мин по сравнению с уровнем гормона у контрольных крыс и базальным уровнем. Через сутки эти различия сохранялись, исключая различия между базальным кортикостероном и уровнем гормона у контрольных крыс; через семь дней подобные соотношения наблюдались на уровне тенденции (табл. 1).

Кортикостерон в плазме крови у 53-дневных самцов и самок крыс после регистрации долговременной памяти в ответ на принудительное плавание. Здесь значим главный эффект воздействия: F(2.36) = = 13.1, p < 0.001, η² = 0.421. Post-hoc анализ показал, что содержание кортикостерона в плазме крови у подопытных и контрольных крыс было выше по сравнению с базальным уровнем гормона, но различий в уровне гормона между подопытными и контрольными крысами, как и между полами, не было выявлено (табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

Приоритетные данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что воспалительная неонатальная боль, вызванная инъекцией формалина в подошву задней конечности, увеличивает у новорожденных крысят содержание кортикостерона в плазме крови по сравнению с контролем. Повышенный уровень стрессорного гормона сохраняется через сутки после инъекции. Периферический очаг воспаления в новорожденном состоянии повышает уязвимость когнитивных процессов у этих животных в поздний препубертатный период развития, притом четко проявляется половой диморфизм в протекании процессов пространственного обучения и кратковременной, и долговременной памяти. Однако не было выявлено прямой взаимосвязи между активацией ГГАКС неонатальной болью у новорожденных и показателями пространственного обучения и памяти у крыс в позднем препубертатном возрасте.

Полученные данные указывают на то, что неонатальная боль вызывает дефицит пространственного обучения у самцов в первой и второй тренировочных пробах, а у самок – только в первой; даже в последний пятый день латентный период достижения платформы был значительно больше по сравнению с контролем у самцов. Вторая за день тренировочная проба наглядно продемонстрировала ухудшение способности повторить выполнение задачи (спустя 4 мин после отдыха) у самцов. Именно во второй пробе обнаружены половые различия в латентном периоде достижения целевого квадранта.

При исследовании пространственной кратковременной и долговременной памяти более яркое влияние неонатальной боли проявилось в показателе продолжительности пребывания в целевом квадранте, чем в показателе латентности достижения платформы. У самцов неонатальная боль вызвала дефицит как кратковременной, так и долговременной памяти. Следует подчеркнуть, что в позднем препубертатном возрасте отсутствовали различия в эффективности выполнения задачи между кратковременной и долговременной памятью, как у контрольных, так и у подопытных крыс.

Нам известно лишь о нескольких исследованиях, выполненных на грызунах, по изучению влияния неонатальной воспалительной боли, вызванной каррагеном или адъювантом Фрейнда, на память. Например, воспалительная боль, вызванная внутриплантарной инъекцией каррагена (1%) в первый день жизни (P0), привела к дефициту пространственной памяти у взрослых крыс [19], а также изменила регуляцию ГГАКС [20]. Инъекция адъюванта Фрейнда на P1 не оказала влияния на кратковременную или долговременную память у крыс на P60, но привела к пространственному дефициту обучения у самцов крыс [21]. Боль, вызванная у новорожденных крыс инъекцией формалина, который производит менее длительную боль, чем воспалительная боль, вызванная каррагеном или адъювантом Фрейнда, нарушила пространственное обучение и память в радиальном лабиринте, в котором используется пищевое подкрепление, у взрослых крыс [22]. Не обнаруженная нами взаимосвязь между активацией ГГАКС неонатальной болью у новорожденных и показателями пространственного обучения и памяти у крыс в позднем препубертатном возрасте может быть обусловлена использованием разной интенсивности действия воспалительных агентов и разном их стрессорном влиянии на ГГАКС.

Ранее мы показали, что воспалительная боль на P1 и P2 не изменила пространственное обучение у 33-дневных самок-подростков в течение только одного тренировочного дня [23]. Более детальное и продолжительное изучение последствий воспалительного болевого воздействия на когнитивные способности и стресс-гормональную систему в подростковом возрасте особенно важно, так как нейробиологические и поведенческие изменения существенно различаются на разных стадиях подросткового возраста, и эти изменения, вызванные стрессовыми раздражителями в раннем возрасте, могут проявляться неодинаково на каждой их этих стадий.

Гиппокамп, медиальная префронтальная кора и миндалина, структуры мозга, вовлеченные в регуляцию ГГАКС [24] и когнитивных способностей [25], могут влиять на чувствительность ГГАКС к половым гормонам и изменять процессы обучения и памяти. Поэтому не исключено, что половые гормоны могут быть одной из причин обнаруженных нами различий в процессах обучения и памяти между самцами и самками в этот критический период развития крысы.

Полученное нами впервые продолжительное усиление реактивности ГГАКС в ответ на воспалительную боль, вызванную инъекцией формалина в подошву задней конечности, у новорожденных крысят, позволило предполагать о модификации в развитии ГГАКС и возможном ее участии в изменении когнитивных способностей. Ноцицептивная система и ГГАКС тесно связаны благодаря восходящим проекциям от дорсального ядра шва, к паравентрикулярному ядру гипоталамуса, а также нисходящим проекциям из гипоталамуса к центру серотонинергических нейронов головного мозга. Однако наши эксперименты показали, что активация ГГАКС неонатальной болью не имеет прямой взаимосвязи с пространственным обучением и памятью у крыс позднего препубертатного возраста. Во влияние боли у новорожденных могут быть включены и другие физиологические системы, такие как иммунная система, которая находится в тесном взаимодействии с ГГАКС, реагирует на воспаление и стресс и поэтому может влиять на нейроны мозга и когнитивные функции. Половые различия в микроглии, нейроиммунных клетках, начинают проявляться в пренатальный период организации половой дифференциации мозга [26], и иммунная система начинает функционировать как регулятор половых различий в развитии мозга и поведения [27, 28]. Современные данные указывают на взаимодействие иммунной и половой систем с ГГАК системой [29]. Взаимосвязь между вышеперечисленными системами может обусловливать наблюдаемые нами и половые различия во влиянии  неонатальной боли на пространственное обучение и память. Можно предположить, что неонатальная боль, нарушая процессы торможения и возбуждения в центральной нервной системе, изменяет синхронизацию развития ГГАКС, гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы (ГГГС) и иммунной системы, которые тесно взаимодействуют друг с другом и влияют на нейропластичность структур, вовлеченных в процессы обучения и памяти.

Надо отметить, что границы препубертатного периода развития с 21-го по 59-й постнатальный день [14] варьируют в зависимости от применяемых критериев (морфогенетические, поведенческие и нейрогормональные). Использование разнополых особей способствует изучению механизмов исследуемых явлений [30]. Вопрос о влиянии неонатальной воспалительной боли на когнитивные процессы и об участии в этом процессе ГГАКС в ходе постнатального онтогенеза требует дальнейших исследований [31]. Полученные нами в настоящей работе результаты на крысах позднего препубертатного возраста, подвергнутых в новорожденном состоянии воспалительной боли, могут быть полезны педиатрам при лечении когнитивных отклонений у подростков с учетом полового диморфизма. Работы, проводимые на животных с использованием модели недоношенной беременности человека, должны осуществляться в тесной связи с исследованиями педиатров с целью фармакологической коррекции нарушений, вызванных неонатальной болью, у подростков с учетом полового диморфизма.