Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2022, T. 58, № 1, стр. 24-33

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведены электрофизиологические исследования на 13 белых беспородных крысах (230±30 г): интактных (n = 3), на ротеноновой модели БП, индуцированной унилатеральным введенем ротенона, и выдержанных до опыта 4 нед (n = 4), и в условиях протекции гидрокортизоном (по 14 инъекций через день в дозе 1.25 мг/кг, 0.1%) (n = 6). Введение ротенона осуществляли в условиях нембуталового наркоза (40 мг/кг, в/б) из расчета 12 мкг в 0.5 мкл Димексида (со скоростью 1 мкл/мин) в “medial forebrain bundle” по координатам стереотаксического атласа [10] (AP+0.2; L±1.8; DV+8 мм). Исследование проводилось в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями руководства ARRIVE [11]. В стереотаксическом аппарате производили трепанацию черепа от брегмы до лямбды и вскрывали твердую мозговую оболочку. Стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика 1–2 мкм, заполненные 2M NaCl, вводили в RMG согласно стереотаксическим координатам (AP-11.6; L+0.2; DV+10.3 мм) для экстраклеточной регистрации спайковой активности одиночных нейронов (рис. 1). Осуществляли высокочастотную стимуляцию (ВЧС) PAG вольфрамовыми электродами посредством прямоугольных толчков тока длительностью – 0.05 мс, амплитудой 0.12–0.18 мВ, силой тока 0.32 мА и частотой 100 Гц в течение 1 с, согласно стереотаксическим координатам (AP-4.92; L+0.3; DV+5.7 мм). Операции осуществляли на наркотизированных животных (уретан 1.2 г/кг в/б), зафиксированных в стереотаксическом аппарате.

Рис. 1.

Схема эксперимента по раздражению PAG и отведению из RMG. Стереотаксическое изображение пункта отведения нейронной активности – (a), зоны стимуляции – (b) и характерного потенциала действия – (c).

Активность проявлялась в виде тетанической потенциации (ТП) и депрессии (ТД) с последующей посттетанической потенциацией (ПТП) и депрессией (ПТД) различной латентности, выраженности и длительности. Проводили программный математический анализ одиночной спайковой активности 390 нейронов. Пре- и постстимульные проявления активности, а также значения фоновой импульсной активности оценивали оn-line регистрацией и программным математическим анализом, позволяющим селекцию спайков амплитудной дискриминацией с выводом “растеров” перистимульного спайкинга нейронов, построением гистограмм суммы и диаграмм усредненной частоты спайков. Производили далее многоуровневую статистическую обработку в отдельности для пре- и постстимульного отрезков времени и периода ВЧС. Для сравниваемых групп спайкинга нейрональной активности, а также произвольно выбранных измерений в отдельном нейроне, строили суммированные и усредненные перистимульные (РЕТН Average) гистограммы и гистограммы частоты (Frequency Average) с вычислением средней частоты спайков. Однородность двух независимых выборок контролировалась t-критерием Стьюдента. С целью повышения статистической достоверности перистимульных изменений межспайковых интервалов использовали также непараметрический двухвыборочный критерий Манна–Уитни Вилкоксона (Wilcoxon–Mann–Whitney test) [12], оценивающий однородность двух независимых выборок. Так как число регистрируемых спайков было достаточно велико (до нескольких сотен спайков за 10–20-секундный интервал после действия стимула), использовалась разновидность указанного теста – z-тест, определяющий его асимптотическую нормальность. Учет критических значений в сравнении с таковыми нормального распределения при уровнях значимости 0.05, 0.01 и 0.001 (для различных испытаний) показывает, что в большинстве случаев спайкинга нейрональной активности при ВЧС статистически значимое изменение достигало как минимум уровня 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Производили экстраклеточную регистрацию спайковой активности одиночных нейронов RMG в норме (122 нейрона, n = 3), на модели БП (149 нейронов, n = 4) и с протекцией гидрокортизоном (119 нейронов, n = 6). Посредством анализа на основе усредненного количества спайков (PETH), с пересчетом в межимпульсные интервалы и частоты в Гц (Frequency Average), были обнаружены cледующие изменения нейрональной активности.

В нейронах RMG в ответ на ВЧС PAG тетаническая депрессия в обеих последовательностях (ТД ПТД и ТД ПТП) в норме определялась порядка 1.66- и 2.0-кратного занижения престимульной активности соответственно (рис. 2a, группы А, B). Тетаническая потенциация, сопровождаемая посттетанической потенциацией и депрессией (ТП ПТП и ТП ПТД), выявлялась в пределах 1.1- и 1.14-кратного превышения престимульной активности (рис. 2b, группы А, B). В нейронах RMG при ВЧС PAG тетаническая депрессия на модели БП определялась в пределах 1.8- и 2.0-кратного снижения престимульной активности в обеих последовательностях соответственно (рис. 2c, группы А, B), а тетаническая потенциация исчислялась порядка 3.33- и 2.66-кратного превышения престимульной активности в обеих последовательностях (рис. 2d, группы А, B). Что же касается депрессорных постстимульных проявлений активности нейронов RMG при ВЧС PAG, то при наличии почти одинаковых значений, в сравнении с нормой, общее количество нейронов, сопровождаемых депрессорными реакциями, на ротеноновой модели многократно уменьшилось. Очевидно чрезмерное синаптическое возбуждение, содействующее повышению частоты пре- и постстимульной активности в обеих последовательностях, характерное для нейродегенеративного поражения RMG. Наконец, в нейронах RMG при ВЧС PAG, в условиях воздействия гидрокортизона, ТД в обеих депрессорных последовательностях достигала, соответственно, 10.5- и 13.0-кратного снижения престимульной активности (рис. 2e, группы А, B), а ТП в соответствующих возбудительных постстимульных последовательностях исчислялась порядка лишь 3.0- и 1.25-кратного превышения престимульной активности (рис. 1f, группы А, B).

Рис. 2.

Усредненные перистимульные (РЕТН Average) гистограммы и гистограммы частоты (Frequency Average) депрессорных, депрессорно-возбудительных (a, c, e, Группы А, B) и возбудительных, возбудительно-депрессорных постстимульных проявлений активности нейронов RMG (b, d, f, Группы А, B) при ВЧС (100 Гц, 1 с) PAG в норме. (a, b), на модели БП (c, d) и в условиях воздействия гидрокортизона (e, f). Для групп указано количество испытаний (n).

Иными словами, при фактическом отсутствии разницы в постстимульных депрессорных реакциях, в нейронах RMG между нормой и патологией (1.66 и 2.0 против 1.8 и 2.0), резкий сдвиг имел место в постстимульных проявлениях активности (1.10 и 1.14 против 3.33 и 2.66), в то время как после воздействия гидрокортизона депрессорные реакции резко повышались в сравнении с БП (10.5 и 13.0 против 1.8 и 2.0). К тому же количество эффектов, вовлеченных в депрессорные реакции, также значительно повысилось в условиях протекции, достигнув 56 и 53. Очевиден протекторный эффект гидрокортизона с успешной нейтрализацией таковых возбудительных – 67 и 65, с естественным уменьшением количества последних до 5 и 5 (рис. 2d, f, группы А, B).

При оценке относительной степени выраженности вышеотмеченных депрессорных и возбудительных постстимульных эффектов, на примере диаграмм усредненной частоты спайков, выведенных на основе растеров пре- и постстимульных депрессорных, депрессорно-возбудительных, возбудительных и возбудительно-депрессорных проявлений спайковой активности нейронов в норме, на модели БП, и в условиях протекции, с указанием средних цифровых значений в реальном времени 20 сек до и после стимуляции, включая время ВЧС, получены дисковые диаграммы для более наглядного представления степени выраженности в частотном отображении (и в %) экспериментальных данных на рис. 6 (на основе рис. 3–5), которые привели к следующему выводу. Значения тетанической депрессии в депрессорной и депрессорно-возбудительной последовательности и уровни тетанической потенциации в возбудительной и возбудительно-депрессорной последовательности нейронов RMG на ВЧС PAG в норме достигали 1.51- и 1.40-кратного снижения (рис. 3, 4; 6 части a, b), 1.30- и 1.29-кратного превышения (рис. 3, 4; 6 части c, d), в сравнении с престимульным уровнем активности соответственно. Как видно, указанные значения отличались незначительно, что свидетельствует о фактическом балансе депрессорных и возбудительных постстимульных проявлений активности исследуемых нейронов. Значения тетанической депрессии в депрессорной и депрессорно-возбудительной последовательности и уровни тетанической потенциации в возбудительной и возбудительно-депрессорной последовательности нейронов RMG на ВЧС PAG, в сравнении с престимульным уровнем активности на модели БП, отличались достаточно (2.00- и 1.31- против 3.12- и 2.54-кратного, для депрессорных и возбудительных эффектов соответственно) (рис. 3, 4; 6 части a–d), что указывает на превалирование возбудительных постстимульных проявлений активности над депрессорными (порядка 1.56- и 2.0-кратного. Наконец, в нейронах RMG при ВЧС PAG значения тетанической депрессии в депрессорной и депрессорно-возбудительной последовательности и уровни тетанической потенциации в возбудительной и возбудительно-депрессорной последовательности, в сравнении с престимульным уровнем активности на модели БП в условиях протекции, исчислялись в пределах 5.06- и 8.96-кратного занижения и 1.39- и 1.29-кратного превышения престимульной активности (рис. 5; 6 части a–d). Иными словами, с учетом лишь кратности измерений сравнительных показателей указанных постстимульных эффектов в патологии, в сравнении с таковыми в условиях протекции, в депрессорной последовательности имело место увеличение тетанической депрессии (5.06 и 8.96 против 2.0 и 1.31 на модели БП, т.е. 2.53 и 6.84-кратно и против 1.51 и 1.40 в норме, т.е. 3.35 и 6.40-кратно), и уменьшение тетанической потенциации в возбудительной и в возбудительно-депрессорной последовательности (1.39 и 1.29 на модели БП с протекцией, против 3.12 и 2.54-кратного на модели БП без протекции, т.е. 2.24- и 2.07-кратно) и с приближением к норме (1.39 и 1.29 против 1.30 и 1.28-кратного).

Рис. 3.

Гистограммы суммы спайков пре- и постстимульных тетанических депрессорных проявлений активности ТД ПТД (a), в сочетании с посттетаническими возбудительными – ТД ПТП (b), возбудительных – ТП ПТП (c), сопровождаемых депрессорными (d), нейронов RMG, вызванных на ВЧС PAG в норме, в реальном времени 20 сек (до и после стимуляции). Растеры активности – детальный анализ произвольно избранных одиночных нейронов из данной группы. Диаграммы частоты спайков, представленных в гистограммах, с усредненными значениями (М) для временных отрезков до (BE – before event), на время тетанизации (TT – time tetanization) и после стимуляции (PE – post event). Справа от диаграмм – количество испытаний (n).

Рис. 4.

Гистограммы суммы спайков пре- и постстимульных тетанических депрессорных проявлений активности ТД ПТД (a), в сочетании с посттетаническими возбудительными – ТД ПТП (b), возбудительных – ТП ПТП (c), сопровождаемых депрессорными (d), нейронов RMG, вызванных на ВЧС PAG на модели БП, в реальном времени 20 сек (до и после стимуляции). Растеры активности на a–d– детальный анализ произвольно избранных одиночных нейронов из данной группы. Справа от диаграмм – количество испытаний (n).

Рис. 5.

Гистограммы суммы спайков пре- и постстимульных тетанических депрессорных проявлений активности ТД ПТД (a), в сочетании с посттетаническими возбудительными – ТД ПТП (b), возбудительных – ТП ПТП (c), сопровождаемых депрессорными (d), нейронов RMG, вызванных при ВЧС PAG на модели БП в условиях протекции гидрокортизоном, в реальном времени 20 сек (до и после стимуляции). Растеры активности на a–d – детальный анализ произвольно избранных одиночных нейронов из данной группы. Справа от диаграмм – количество испытаний (n).

Рис. 6.

Процентное и цифровое соотношение степени выраженности (по усредненной частоте) (a–d), депрессорных (ТД ПТД), депрессорно-возбудительных возбудительных (ТД ПТП), возбудительных (ТП ПТП) и возбудительно-депрессорных (ТП ПТД) постстимульных эффектов в одиночных нейронах RMG при ВЧС PAG, а также частоты престимульной (e–h) и постимульной (i–l) активности, предшествуемых и сопровождаемых указанными проявлениями постстимульной активации, в норме, на ротеноновой модели БП и в условиях протекции гидрокортизоном.

Интересная картина была обнаружена при сравнении частоты пре- и постстимульной активности нейронов RMG при ВЧС PAG в указанных экспериментальных условиях. Престимульная частота активности, предшествующая депрессорным эффектам в норме и на модели БП, достигала кратных значениий 11.63, 9.03 и 28.54, 5.26 соответственно, а предшествуемая возбудительными последовательностями в норме и патологии 22.85, 16.83 и 70.34, 89.08 соответственно (рис. 3, 4; 6e–h). Престимульная частота активности в нейронах RMG, предшествующая депрессорным и возбудительным последовательностям в условиях протекции, исчислялась в пределах 34.70, 20.70, 9.17 и 9.31, соответственно, по сравнению с 11.63, 9.03, 22.85, 16.83 в норме и 28.54, 5.26, 70.34, 89.08 в патологии без протекции (рис. 3–5; 6e–h).

Что же касается постстимульной частоты активности нейронов RMG, то в норме, будучи сопровождаемой депрессорными и возбудительными постстимульными эффектами, она достигала 7.70, 6.45, 29.40 и 21.52, а на модели БП – 15.0, 4.0, 219.48 и 226.10 (рис. 3, 4; 6i–l). Иными словами, на модели БП частоты активности нейронов RMG, сопровождаемая депрессорными реакциями, превысила норму 2.05-кратно и снизилась 1.61-кратно, соответственно, и намного превысилась порядка 7.46- и 10.50-кратно, сопровождаемая возбудительными эффектами. Таким образом, имело место мощное повышение частоты постстимульной активности, свидетельствующее опять, как и в случае престимульной частоты, о чрезмерном синаптическом возбуждении (рис. 3, 4; 6i–l). Наконец, в условиях протекции произошло фактическое приближение депрессорной постстимульной активности к норме (6.85 против 7.70, 2.31 против 6.45) и резкое снижение постстимульной частоты на модели БП, сопровождаемой возбудительными эффектами (12.75 против 219.48 и 12.00 против 226.10, т.е. 17.21- и 18.84-кратно), с приближением к норме (29.40 и 21.52), что свидетельствует об успешном протекторном эффекте гидрокортизона (рис. 3–5; 6i–l).

Несмотря на интенсивные исследования путей, передающих боль, недостаточно внимания уделялось тем из них, которые участвуют в восприятии боли и ее модуляции, т.е. антиноцицептивным, важным компонентом которых являются RMG и PAG. Необходима оценка механизмов боли [3, 4]. Интерес к изучению соотношения возбудительных и депрессорных (тормозных) синаптических процессов в отмеченных антиноцицептивных структурах в норме диктуется необходимостью оценки их поражения в условиях НБ, что в настоящее время весьма актуально, поскольку нет доступной терапевтической стратегии для подавления нестерпимой хронической боли, в частности при БП, в которой среди самых частых немоторных сенсорных отклонений ей принадлежит особое место [4]. Что касается клеточно-молекулярных механизмов повреждений, вызываемых ротеноном, и связи этих нарушений с патологическими изменениями, развивающимися при БП, то следует отметить следующее. Ротенон, на основании которого получена нами модель БП и которому повящено настоящее исследование, содействует дегенерации нигростриатного дофаминергического пути, избирательному окислительному повреждению стриатного тела и образованию убиквитин- и α-синуклеин позитивных включений в нигральных клетках, которые сходны с тельцами Леви при БП [13]. К тому же ротеноном индуцированная модель воспроизводит большинство патогенетических механизмов БП, в том числе, формирование нейрональных включений и окислительный стресс [14, 15]. Наконец, на ротеноновой модели получены расстройства, нарушения в эмоционально-чувственной сфере, которые, как известно, являются важнейшими немоторными проявлениями БП [14]. Вместе с LC, RMG, вовлекается в аффективное и когнитивно-оценочное измерение боли, болевую память и автономные ответы [4]. Хотя точные патогенетические механизмы, приводящие к гибели клеток при БП, не вполне понятны, известен ряд факторов, включающих митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс, эксайтотоксичность, дисфункцию убиквитин-протеасомного пути и апоптоз. В отличие от других моделей, ротенон воспроизводит большинство симптомов расстройства движений и гистопатологические особенности БП (в частности, образования телец Леви) и является мощным ингибитором митохондриального дыхания, а последние эпидемиологические исследования показали важную роль ротенона и других пестицидов в развитии спорадического паркинсонизма у населения сельской местности [16]. Согласно другим данным, при системном введении лишь около 20% введенного ротенона попадает в головной мозг, а 80% обусловливает периферическую токсичность внутренних органов крыс [17]. Но токсическое действие на внутренние органы исчезает при стереотаксическом введении ротенона [18], что собственно и было использовано в настоящем исследовании. В заключение, ротеноновые модели на крысах являются моделями, наиболее приближенными к патогенезу болезни БП у человека, в отличие от других нейротоксических моделей, что важно в эволюционном аспекте возможности оценки патологических отклонений и протекции, тождественных для животных и людей [1]. Как было отмечено выше, из ротеноновых моделей in vivo наиболее адекватными являются модели со стереотаксическим и интрацеребральным введением ротенона в черное вещество среднего мозга, что собственно и было использовано в настоящем исследовании. Таким образом, на модели БП выявлено мощное превышение возбудимости постстимульных синаптических процессов в RMG при ВЧС PAG, являющееся неизбежным результатом БП. Следует полагать ее аналог эксайтотоксичности при НБ, возникающей в качестве компенсаторной реакции на снижение возбуждения в результате гибели нейронов, повреждающей их сверхактивацией глутаматных NMDA- и AMPA-рецепторов [19], тем самым вызывая апопотоз нейронов и последующую гибель [20, 21]. В целом эксайтотоксичность сопровождается нарушением кальциевой буферизации, генерацией свободных радикалов, активацией митохондриальной проницаемости и вторичной эксайтотоксичностью [22]. Отмеченное, согласно нашему предыдущему сообщению, свидетельствует о необходимости углубления, в условиях нейродегенерации, депрессорных эффектов, несущих протекторную нагрузку и снижающих чрезмерные возбудительные реакции [23].