Журнал физической химии, 2019, T. 93, № 9, стр. 1401-1409

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез фосфатов полисахаридов (ФП) в системе, содержащей ортофосфорную кислоту (“ч”, ГОСТ 6552-80, $\rho _{4}^{{20}} = 1.698$ г/мл; с = 85.4%), трибутилфосфат (“х. ч.”, Alfa Aesar, $\rho _{4}^{{20}} = 0.98$ г/мл), оксид фосфора(V) (“ч”, ТУ 6-09-417385) проводили в течение 6–50 ч при температуре 313 K согласно методу [4]. Смешанные эфиры полисахаридов (ФКП), содержащие одновременно фосфатные и карбаматные группы, получали путем обработки полисахаридов смесями ортофосфорной кислоты и мочевины (“ч”, ГОСТ 6691-77) при разном мольном соотношении в течение 4 ч при температуре 408 K, давлении 0.005–0.010 МПа [9]. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры добавляли дистиллированную воду, продукт реакции этерификации переводили в Na-форму, для чего приливали 30%-ный раствор NaCl в водно-этанольной смеси (содержание спирта 70%, модуль ванны 1 : 20 г/мл), подщелоченный гидроксидом натрия до рН 11–12.

Продукты реакции (ФП, ФКП) промывали пятикратно 50%-ным раствором этилового спирта (массовый модуль 1:10), высушивали.

Состав продуктов реакции, степень набухания (Q) определяли методами элементного анализа, ИК-спектроскопии, гравиметрии [5, 9–14]. Характеристики фосфатов полисахаридов и условия реакции приведены в табл. 1.

Фосфаты крахмала и декстрана получали в виде микрогелей с размерами в диапазоне от 0.05 до 1050 мкм (максимальное объемное содержание (25–60%) колеблется в интервале 150–450 мкм), а также фосфат целлюлозы, представляющий собой гелеобразующую пористую салфетку. Ширина и толщина волокон салфетки фосфата целлюлозы составляли 10–50 мкм и 1–5 мкм соответственно. Фосфат декстрана (ФД) и целлюлозы (ФЦ) после обработки в системе ортофосфорная кислота–оксид фосфора(V)–трибутилфосфат находились в Н-форме.

Для проведения потенциометрического титрования образцы Na-соли смешанных эфиров ФКК и ФКД, содержащие фосфатные и карбаматные группы, переводили в Н-форму обработкой 0.2 н. раствором соляной кислоты в смеси вода:этанол (содержание спирта – 70%) в течение 30 мин. Н-форму фосфорилированных полисахаридов (ФКП) отфильтровывали на фильтре Шотта с размером 100 мкм, промывали путем контактирования с 50%-ным раствором этанола при перемешивании в течение 1.5–2 ч (массовый модуль 1:10) и последующим фильтрованием на фильтре Шотта.

Потенциометрическое титрование образцов ФП и ФКП в Н-форме проводили методом одной навески на фоне ионной силы 0.05 [15]. Титрование образцов осуществляли 0.05 н. раствором гидроксида натрия, содержащим фиксированное количество NaCl в качестве фонового электролита. Отношение массы катионита к объему раствора составляло 1:250 г/мл.

Для описания кислотных свойств катионитов в работе использовано уравнение Гельденсона–Гассельбаха:

где n – коэффициент кооперативности процесса ионизации; α_i – степень ионизации фосфорнокислых групп по первой и второй ступени: $V$ – объем раствора гидроксида натрия в точке эквивалентности, мл; ${{\tilde {N}}_{{{\text{NaOH}}}}}$ – концентрация раствора гидроксида натрия, М; $m$ – масса навески абсолютно сухого образца, г.

Оценку противоопухолевого эффекта гидрогелей на основе ФКП и ФП в условиях in vitro проводили на монослойной культуре опухолевых клеток Hela (эпителиоидная карциома шейки матки человека, клон М) путем сравнения количества выживших клеток с их исходным числом до воздействия гидрогелей:

где N_о и N_к – среднее число клеток в опытной и контрольной группах в конце эксперимента, N_исх – исходное число клеток, перед добавлением ФП и ФКП, а также на основании показателя эффективности противоопухолевого действия (ИК₅₀), численно равного концентрации гидрогелей, вызывающей ингибирование пролиферации на 50%.

Сравнительное изучение противоопухолевой активности фосфорилированных полисахаридов на примере ФКД в опытах in vivo проводили на моделях саркомы М-1 (Банк опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва) и саркомы Йенсена (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Исследование проводили в соответствии с техническим кодексом “Надлежащая лабораторная практики” (введен Постановлением МЗ РБ от 28.03.2008 г. № 56) и международными этическими и научными стандартами качества планирования и проведения исследований на животных (Хельсинская декларация Всемирной медицинской ассоциации, 2000 г.).

Для экспериментов крысам перевивали опухоли подкожно в область левого бедра, вводя 0.5 мл 20%-й взвеси опухолевой ткани. Эксперименты проводили на 7–10 сутки после перевивки опухоли крысам (80 крыс с саркомой М-1 и 40 крыс с саркомой Йенсена). Гидрогели ФП и ФКП вводили однократно внутрибрюшинно (в объеме 1 мл на 100 г массы животного). В качестве критериев оценки противоопухолевой эффективности гидрогелей ФКД использовали динамику роста опухолей, измерение объема которых проводили 3 раза в неделю, а также процент торможения опухоли.

Объем опухолей (V, см³) измеряли по формуле:

где a, b, c – линейные размеры опухоли, см. Процент торможения опухоли (Т, %) рассчитывали по уравнению: где: V_к и V_о – средние размеры опухоли у крыс контрольной и опытной групп.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Обработка полисахаридов в системах ортофосфорная кислота–мочевина и ортофосфорная кислота–оксид фосфора(V)–трибутилфосфат является известным методом введения в их состав фосфорсодержащих групп. Согласно данным [10, 11], в указанных смесях в условиях реакции протекают процессы образования полифосфорных кислот, которые влияют на ход этерификации и могут приводить к получению гелеобразующих катионитов.

Возможные фосфорсодержащие группы в составе катионитов приведены ниже:

где R – остаток полисахарида.

Видно, что каждый атом фосфора в фосфатах полисахаридов имеет одну сильнокислотную гидроксильную группу, а концевые фосфаты – дополнительно слабокислотную группу. Для полученных катионитов, в состав которых могут входить двухосновные, одноосновные фосфаты и полифосфаты, экспериментально можно определить только две усредненные константы ионизации: для сильнокислотных и слабокислотных групп.

Наличие в составе продуктов реакции фосфатов подтверждено методом ИК-спектроскопии [4, 5]. В ИК-спектре Na-формы фосфорнокислых катионитов появляются полосы поглощения в области 955–1055 см^–1 (симметричные и асимметричные валентные колебания групп C–Р–О), полосы поглощения при 1220 см^–1 (валентные колебания группы Р=О) и 760 см^–1 (валентные колебания связи –Р–О–Р–), которые свидетельствуют о присутствии в составе катионитов фосфатов и полифосфатов. Интенсивная полоса поглощения при 1715 см^–1 в ИК-спектрах ФКД, полученных в системе ортофосфорная кислота–мочевина, обусловлена асимметричными валентными колебаниями связей С=О карбаматных групп [5, 11].

На рис. 2–4 приведены кривые потенциометрического титрования фосфорилированных полисахаридов: крахмала, декстрана, целлюлозы. Результаты сравнения кривых титрования, полученных разными способами, показывают, что в области рН < 5.0, соответствующей полной нейтрализации сильнокислотных групп, они практически идентичны. Совпадение кривых свидетельствует о том, что показатели кислотности по первой ступени фосфорнокислых катионитов не чувствительны к методу синтеза, а также природе полисахарида, входящего в их состав (табл. 1). Следовательно, при ионизации сильнокислотных групп первой ступени избирательность сорбции катионов натрия разными фосфорнокислыми катионитами одинакова, что свидетельствует о наличии достаточно сильных электростатических взаимодействий функциональная группа – противоион, нивелирующих индивидуальные особенности различных катионитов.

По мере увеличения степени диссоциации функциональных групп (рН > 5.0) различия между кривыми рН = f(m_NaOH) фосфатов полисахаридов, полученных разными способами, возрастают: наиболее четко выражены точки перегиба для ФД и ФЦ, полученных в системе ортофосфорная кислота–оксид фосфора(V)–трибутилфосфат. Одновременно на дифференциальных кривых титрования данных катионитов наблюдаются два максимума, положение которых соответствует обменной емкости по первой ступени (ОЕ₁) и полной обменной емкости (ПОЕ). Видно, что интервалы до первой точки и от первой до второй точек эквивалентности, соответствующей обменной емкости слабокислотных групп (ОЕ₂), практически равны между собой. Это свидетельствует о том, что в состав катионитов, полученных в системе ортофосфорная кислота–оксид фосфора(V)–трибутилфосфат, входят преимущественно однозамещенные фосфорнокислые группы.

Из рис. 2 видно, что для смешанных эфиров ФКК и ФКД, полученных в системе ортофосфорная кислота–мочевина, зависимость рН = = f(m_NaOH) имеет смазанный вид: для участка титрования слабокислотных групп характерно наличие не только одной, но несколько неявно выраженных ступеней, аналогичных кривым титрования полифункциональных кислот. При этом эффект выравнивания кривых титрования слабокислотных групп возрастает с ростом содержания в образцах фосфора, а также при переходе от ФКД к ФКК, имеющего более низкую степень набухания (табл. 1). Соответственно (рис. 2б) на дифференциальных кривых имеется только один ярко выраженный пик: в более щелочной области рН он либо размыт, либо отсутствует. Как следует из дифференциальной кривой смешанных эфиров ФКК и ФКД, количество щелочи, пошедшее на титрование слабокислотных групп больше, чем слабокислотных, что не согласуется с представленными выше структурными формулами. Вероятная причина этого – частичное перекрывание процессов титрования сильно- и слабокислотных групп.

Очевидно, существенным фактором, влияющим на электролитические свойства слабокислотных групп гидрогелей смешанных эфиров, является наличие в их составе дополнительных полярных карбаматных групп (табл. 1), образующих интенсивные внутри- и межмолекулярные водородные связи с фосфатными, гидроксильными группами катионита и играющих важную роль в формировании его сшитой структуры, доступности функциональных групп для титранта. Следует отметить, что локальная прочность системы водородных связей будет зависеть как от локальной концентрации функциональных групп, так и от числа химических сшивок между макромолекулами полисахарида, образованных при участии двухзамещенных фосфатов (структура V, IV). Неоднородность системы водородных связей в гидрогелях может быть причиной неоднородности кислотности слабокислотных групп [16].

Таким образом, сопоставление кривых потенциометрического титрования фосфорилированных полисахаридов позволяет сделать вывод, что ФП, синтезированные в системе ортофосфорная кислота–оксид фосфора(V)–трибутилфосфат, представляют собой двухосновные катиониты. В то же время кривые титрования смешанных эфиров крахмала и декстрана, полученные в системе ортофосфорная кислота–мочевина, имеют вид, характерный для полифункциональных катионитов.

Для определения показателя кислотности сильно- и слабокислотных групп катионитов использовали графический способ решения уравнения Гендерсона–Гассельбаха. Из рис. 3 видно, что зависимость между рН раствора и величиной lg(1 – α₁/α₁) в области титрования сильнокислотных групп характеризуется двумя прямыми: одна – при значениях степени нейтрализации (α₁) до 0.4–0.5 и вторая – α > 0.5. Аналогичная зависимость рН = f[lg(1 – α/α)] наблюдалась и для других полиэлектролитов, например, полиметакриловой кислоты [15]. Известное объяснение этого факта состоит в том, что существенный вклад в энергию Гиббса при ионизации функциональных групп полиэлектролитов вносит процесс конформационных переходов сегментов макромолекул.

Согласно литературным данным, можно предположить, что при α₁ < 0.4 происходит нейтрализация, во-первых, сильнокислотных групп, расположенных на поверхности гидрогелей, в области пор и дефектов и связанных между собой более слабыми водородными связями; во-вторых, сильнокислотных групп, ставших доступными в результате конформационных превращений. Эффект конформационных превращений макромолекул связан с тем, что по мере роста α₁ электролитическое отталкивание ионизированных фосфатных групп становится способным разрывать межмолекулярные водородные связи, которые в гидрогелях могут образовываться как между недиссоциированными фосфорсодержащими группами одной или соседних цепей, так и между фосфатными и гидроксильными, фосфатными и карбаматными группами. Разрушение межмолекулярных водородных связей на участках макромолекул между сшивками сопровождается раскручиванием и выправлением сегментов макромолекул в полимерной сетке гидрогелей, что приводит к росту доступности функциональных групп и способствует усилению кислотности гидрогелей. Следует отметить, что изменение конформации полимерной сетки сопровождается значительным увеличением степени набухания гидрогелей (в ∼2–3 раза).

При α₁ > 0.5 наклон линейной зависимости рН = = f[lg(1 – α₁/α₁)] резко увеличивается, т.е. характер зависимости кислотных свойств ФП и ФКП от α₁ становится типичным для катионитов и объясняется влиянием кулоновского эффекта на энергию взаимодействия протонов с фосфатными группами гидрогелей [15]. Следует отметить, что характер зависимости рН = f[lg(1 – α₁/α₁)] и значение α₁, при котором наблюдается перелом кривых, практически не зависит от природы полисахарида, способа получения, что может указывать на определяющую зависимость конформационных изменений от наличия фосфатных групп.

Полученная зависимость рН от степени ионизации сильнокислотных групп обусловливает некорректность расчета константы ионизации сильнокислотных групп рK₁ согласно уравнению Гендерсона–Гассельбаха. В данном исследовании значение рK₁ (табл. 1) принимали равным рН при степени нейтрализации 0.5.

В области рН > 5.0, где титруются слабокислотные группы, для ФП, синтезированных в системе ортофосфорная кислота–оксид фосфора(V)–трибутилфосфат, имеет место линейная зависимость рН = f[lg(1 – α₂/α₂)]. Это свидетельствует о том, что на данном участке кривой титрования существенные изменения структуры гидрогелей отсутствуют. Необходимо отметить, что оценка рK₂ фосфатов полисахаридов, синтезированных в системе ортофосфорная кислота–мочевина, в работе не проведена, так как определить полную обменную емкость смешанных эфиров по экспериментальным данным, представленным на рис. 1 и 2, невозможно. Рассчитанные по уравнению Гендерсона–Гассельбаха значения pK₂ ряда катионитов представлены в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что величины pK₁ фосфорилированных полисахаридов сравнительно мало зависят от концентрации фосфатных групп в фазе гидрогеля, природы полисахарида, способа этерификации. Как свидетельствуют полученные результаты, величины pK₁ = 2.5–2.9 для ФП и ФКП выше по сравнению с pK сильнокислотных групп низкомолекулярных ортофосфорной (pK₁ = 2.0), а также пирофосфорной (pK₁ = = 1.09, pK₂ = 2.0) кислот. В то же время показатель кислотности второй ступени ионизации (pK₂ = =  6.5–6.9) фосфорнокислых групп ФП по величине соответствует показателю кислотности слабокислотных групп фосфорной (pK₂ = 6.8) и пирофосфорной (pK₃ = 6.6) кислот.

Из табл. 1 видно, что гелеобразующие фосфорилированные полисахариды являются катионитами с полной обменной емкостью в интервале 4.4–8.9 мг-экв г^–1 и могут найти применение в медицине в качестве полимеров-носителей биологически активных веществ, в частности, противоопухолевых веществ.

Результаты сравнительного исследования собственной противоопухолевой активности фосфатов полисахаридов в условиях in vitro представлены в табл. 2. Из данных табл. 2 видно, что цитостатическая активность фосфорилированных полисахаридов является дозозависимой и при фиксированной концентрации образцов увеличивается по мере роста содержания в катионитах фосфорнокислых групп. В то же время существенных различий в противоопухолевой активности фосфатов полисахаридов в зависимости от природы исходного полисахарида (крахмал, декстран), способа получения не выявлено.

Противоопухолевый эффект фосфата декстрана был подтвержден в опытах in vivo (рис. 5). Как видно из рис. 5, после введения ФКД объем опухолей (V, см³) крыс по сравнению с контролем уменьшается, что свидетельствует о том, что гидрогели вызывают торможение роста опухолей. Процент торможения опухоли для суспензии гидрогелей ФКД на 28 сутки наблюдения животных составлял 57% для саркомы Йенсена – 92%.

Таким образом, сравнительный анализ данных потенциометрического титрования показал, что фосфаты полисахаридов, полученные в системе ортофосфорная кислота–трибутилфосфат–оксид фосфора(V), являются двухосновными катионитами. Кривые титрования смешанных эфиров полисахаридов, полученные путем этерификации в системе ортофосфорная кислота–мочевина, имеют вид, характерный для полифункциональных катионитов. Значения pK₁ полученных полиэлектролитов находятся в пределах 2.5–2.9 и практически не зависят от способа получения, природы полисахарида, концентрации функциональных групп. Отличия на участке потенциометрической кривой в области титрования слабокислотных групп связаны с наличием в смешанных эфирах крахмала и декстрана карбаматных групп, которые способствуют формированию более сшитой структуры гидрогелей, затрудняющей ионизацию фосфатных групп по второй ступени. В опытах in vitro и in vivo показано, что включение фосфатных групп в состав полисахаридов приводит к повышению их противоопухолевой активности.