Журнал физической химии, 2021, T. 95, № 7, стр. 1089-1094

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследована адсорбция щелочной фосфатазы слизистой кишечника быка. Щелочная фосфатаза – димерный фермент, относительная молекулярная масса протомера 69000, pI 5.7. Использован лиофилизированный препарат (SIGMA) с содержанием белка 25%.

Адсорбционные измерения. Адсорбцию проводили из водных растворов фермента в интервале концентраций 50–800 мкг/мл. К 50 мг адсорбента добавляли 5 мл раствора фермента и оставляли в холодильнике на 5 суток. Величину адсорбции рассчитывали по разности концентраций фермента в исходном и конечном растворах. После окончания адсорбции образцы промывали несколько раз водой для удаления остатков фермента, добавляли по 5 мл воды и оставляли в холодильнике на 5 суток для проверки обратимости адсорбции. Величина десорбции фермента не превышала 2%, т.е. в исследованных условиях адсорбция щелочной фосфатазы практически необратима.

Определение концентрации щелочной фосфатазы. Содержание активного фермента определяли по скорости гидролиза динатриевой соли п-нитрофенилфосфата в 0.05 М карбонатном буфере (рН 8.5). Использовали насыщающие концентрации субстрата (3.5 мМ). Ферментативную реакцию проводили в стеклянной кювете (l = 1 см). Скорость накопления окрашенного продукта реакции – п-нитрофенола – определяли фотометрированием при λ = 400 нм. Предварительно строили калибровочные зависимости.

Определение параметров уравнения Михаэлиса–Ментен. Константа Михаэлиса (К_М) и максимальная скорость (V), характеризующие каталитические свойства ферментов, определяли для щелочной фосфатазы в растворе и на поверхности образцов галлуазита в реакции гидролиза синтетического субстрата (динатриевая соль п-нитрофенилфосфата, SIGMA). Ферментативную реакцию проводили в фосфатном буфере (рН 7.5), интервал концентраций субстрата 0.15–1 мМ. Для обработки экспериментальных данных использовали линейное уравнение Лайнуивера–Берка.

Термоинактивация щелочной фосфатазы. Растворы фермента в фосфатном буфере (рН 7.5, оптимум рН стабильности фермента) и гетерогенные образцы подвергали термообработке при 59°С. Время термообработки варьировали от 15 мин до 2 ч. Полученные зависимости активности фермента от времени термообработки обрабатывали в координатах кинетического уравнения первого порядка и определяли эффективные константы скорости термоинактивации.

Физико-химические методы исследования. Определение параметров пористой структуры галлуазита проводили на сорбтометре АSАР 2010 (Micromeritics, США). Предварительно образцы вакуумировали при 50°С в течение 10 ч.

Электронные микрофотографии образцов галлуазита получали на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-6000 NeoScope.

Адсорбенты. Исследовали 4 образца галлуазита (производитель ООО “МТиНМ”, Россия), текстурные параметры которых приведены в табл. 1.

Значения D₁ и D₂ – положения максимумов на кривых распределения объемов пор по их размерам (рис. 1). Считается, что первый максимум соответствует порам внутренней поверхности галлуазита, включая и межслоевые пространства, а второй максимум – среднему размеру внутренних диаметров нанотрубок [10]. Приведенные на рис. 2 электронные микрофотографии свидетельствуют о различной морфологии исследованных образцов галлуазита. Образец 1 состоит в основном из трубчатых структур, тогда как в других образцах помимо трубчатых структур присутствуют сферические и пластинчатые структуры, а также их агломераты.

Рис. 1.

Кривые распределения объемов пор образцов галлуазита по их размерам. Номер кривой соответствует номеру образца.

Рис. 2.

Электронные микрофотографии образцов: галлуазит-1 (а, в); галлуазит-2 (б, г); галлуазит-3 (д) и галлуазит-4 (е).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На рис. 3 приведены изотермы адсорбции щелочной фосфатазы на образцах галлуазита. При адсорбции на образцах 1 и 4 получены изотермы L-типа, а на образцах 2 и 3 – двухступенчатые изотермы. Все изотермы адсорбции обработаны в линейных координатах уравнения Ленгмюра и рассчитаны предельные величины адсорбции фермента. В случае образцов галлуазит-2 и галлуазит-3 определены два значения предельной адсорбции. Полученные величины приведены в табл. 2.

Рис. 3.

Изотермы адсорбции щелочной фосфатазы на образцах галлуазита в расчете на единицу массы (а) и единицу поверхности (б). Номер зависимости соответствует номеру образца.

Изотермы адсорбции ферментов на образцах галлуазита ранее получены для липазы [5, 6], лизоцима [6] и пероксидазы [8], однако авторы этих публикаций изотермы никак не обрабатывали.

Из приведенных на рис. 3 и в табл. 2 данных следует, что максимальные адсорбции получены на образцах, обладающих меньшей удельной поверхностью. Причем, если в расчете на единицу массы адсорбция различается в 2–3 раза, то в расчете на единицу поверхности – практически на порядок. На порядок различаются и рассчитанные из предельной адсорбции площадки, приходящиеся на одну молекулу фермента на поверхности этих образцов (табл. 2). По-видимому, наличие значительных количеств микропор в образцах 2 и 3 препятствует закреплению молекул белка на поверхности. Полученные нами предельные адсорбции можно сравнить с величинами адсорбции α-амилазы и уреазы на галлуазите (S_БЭТ = 60 м²/г и внутренний диаметр 20 нм [2]). Величины адсорбции составили 15 и 11.7 мг/г соответственно для уреазы и α-амилазы. В расчете на единицу поверхности – 0.25 и 0.20 мг/м², что вполне укладывается в найденную нами тенденцию уменьшения адсорбции с увеличением удельной поверхности. К сожалению, в других работах по адсорбции ферментов на галлуазитах [3–9] нет сведений о текстурных характеристиках образцов.

В табл. 3 приведены параметры уравнения Михаэлиса–Ментен, характеризующие каталитические свойства фермента в растворе и на поверхности исследованных образцов галлуазита.

Проведенное исследование показало, что щелочная фосфатаза на поверхности галлуазита сохраняет не более 1% по сравнению с активностью в растворе (см. табл. 3). По литературным данным лакказа на поверхности галлуазита сохраняла ~20% активности [4], липаза – до 80% [5]. Константа Михаэлиса в случае гетерогенных образцов возрастает в несколько раз по сравнению с полученной для фермента в растворе, что характерно для иммобилизованных ферментов. В литературе приведены параметры уравнения Михаэлиса–Ментен для хлоропероксидазы, иммобилизованной на галлуазите в реакции хлорирования монохлордимедона [3]. Аналогичные параметры для нативного фермента не сообщаются.

Интересные результаты получены при проведении ферментативной реакции последовательно на одном и том же образце. Как видно из рис. 4, образцы, сохранившие минимальную активность (галлуазит-1 и галлуазит-4) не теряют активности при проведении шести последовательных циклов на одном и том же образце. Два других образца, сохранивших активность в большей степени, постепенно теряли активность, если каталитическую реакцию проводили последовательно на одном и том же образце. Различается и термостабильность гетерогенных биокатализаторов. Кинетические зависимости термоинактивации щелочной фосфатазы при 59°С в буферном растворе (7.5) и фермента на поверхности исследованных образцов галлуазита приведены на рис. 5. Рассчитанные из экспериментальных данных эффективные константы скорости термоинактивации приведены в табл. 3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфатаза на поверхности галлуазита более стабильна при воздействии повышенных температур. В буферном растворе в оптимуме рН стабильности (рН 7.5) при 59°С фермент теряет половину активности менее, чем за 15 мин, а фосфатаза на поверхности образцов 1 и 4 не теряет первоначальной активности, по крайней мере, в течение 2 ч. Фермент на поверхности образца галлуазит-2 не теряет активности после 15 мин выдержки при 59°С, а на галлуазит-3 потеря активности начинается с первых минут термообработки. Константа скорости инактивации щелочной фосфатазы в растворе в 5–10 раз выше, чем на образцах 3 и 2 (соответственно 12.3 × 10^–4, 2.3 × 10^–4 и 1.2 × 10^–4 с^–1). Термостабильность адсорбционных слоев ферментов – одно из преимуществ гетерогенных биокатализаторов. Это свойство отмечено ранее и для ферментов, иммобилизованных на поверхности галлуазита [3, 5, 6].

Рис. 4.

Каталитическая активность щелочной фосфатазы на поверхности галлуазита при последовательном проведении эксперимента. Номер зависимости соответствует номеру образца.

Рис. 5.

Кинетические зависимости в координатах уравнения первого порядка для термоинактивации щелочной фосфатазы на поверхности галлуазита-1 и галлуазита-4(1), галлуазита-3 (2), галлуазита-2(3) и в растворе (4).

Таким образом, максимальные величины адсорбции щелочной фосфатазы (в расчете на единицу массы и на единицу поверхности) получены на образцах галлуазита с небольшой величиной удельной поверхности (28 и 50 м²/г). Установлено, что десорбция ферментов с поверхности галлуазитов составляет не более 2%, а каталитическая активность – не более 1% по сравнению с активностью нативного фермента. Щелочная фосфатаза на поверхности всех исследованных образцов галлуазита более устойчива к воздействию повышенных температур, чем в растворе. По другим свойствам образцы можно разделить на две группы и выделить общие свойства адсорбционных слоев щелочной фосфатазы для каждой группы.

К первой группе отнесены образцы, у которых внутренние диаметры нанотрубок максимальные, – галлуазит-1 (S_БЭТ = 28 м²/г, D_мах = 50 нм) и галлуазит-4 (S_БЭТ = 215 м²/г, D_мах = 50 нм). Для этих образцов характерны изотермы адсорбции L-типа и постоянство активности фермента при многократном проведении реакции на одном и том же образце, а также сохранение каталитической активности фермента на поверхности образцов после обработки при 59°С в течение 3 ч.

Ко второй группе отнесены образцы с меньшими внутренними диаметрами нанотрубок – галлуазит-2 (S_БЭТ = 50 м²/г, D_мах = 12 нм) и галлуазит-3 (S_БЭТ = 250 м²/г, D_мах = 25 нм). Для этих образцов характерны двухступенчатые изотермы адсорбции, падение каталитической активности при многократном проведении ферментативной реакции на одном и том же образце и значительно меньшая термостабильность фермента на поверхности этих образцов по сравнению с образцами галлуазит-1 и галлуазит-4.

Проведенное исследование показало, что особенности адсорбции щелочной фосфатазы (а, возможно, и других ферментов) и свойства адсорбционных слоев ферментов в значительной степени определяются текстурными параметрами образцов галлуазита.

Исследование текстурных и морфологических характеристик образцов галлуазитов выполено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 19-73-10160).