Журнал физической химии, 2021, T. 95, № 9, стр. 1379-1384

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В экспериментах использовали ПК товарной марки Unipectine XPP 240 с молекулярной массой 26000 Дa и степенью этерифицирования 66%. Phe, His марки “х.ч.” использовали без дополнительной очистки и высушивали в вакуумном шкафу перед взятием навесок до постоянной массы при 343 К. Спектры ЯМР ¹³C растворов образцов в D₂O регистрировали на спектрометре Bruker Avance III 500 MHz. ИК-спектры образцов записывали на спектрометре Shimadzu IR-Prestige-21 (700–3600 см^–1, вазелиновое масло). Величину удельного вращения измеряли на поляриметре “Perkin-Elmer” (модель 141). УФ-спектры водных растворов соединений снимали в кварцевых кюветах толщиной 1 см на спектрофотометре UV-VIS SPECORD M-40. Кислотность растворов контролировали на pH-метре “АНИОН 4100”. Необходимую кислотность раствора создавали растворами НCl и NaOH.

Состав образующихся соединений при взаимодействии ПК с АК определяли спектрофотометрическими методами изомолярных серий и мольных отношений при рН 7.0 [25]. Суммарная концентрация полисахарида и аминокислоты в изомолярной серии составляла 1 × 10^–4 моль/л. Молярные отношения [ПК] : [АК] варьировали от 50 : 1 до 1 : 20. В сериях растворов с постоянной концентрацией АК, равной 1 × 10^–4 моль/л, концентрацию ПК изменяли от 1 × 10^–5 до 1 × × 10^–3 моль/л. Ионную силу поддерживали постоянной, равной 0.1 моль/л (NaCl, “х.ч.”).

По методу мольных отношений [25] спектральные изменения для раствора ПК + АК описываются уравнением:

где А и А₀ – оптические плотности растворов в присутствии и отсутствии ПК, [АК]₀ –начальная концентрация соответствующей аминокислоты, ε и ε₀ – молярные экстинкции соответствующего состава, β_k – константа устойчивости, [ПК] – концентрация пектина.

Из графика зависимости [АК]₀/(А – А₀) от 1/[ПК] по тангенсу угла наклона находили константу устойчивости комплексов.

Тепловые эффекты реакции образования комплексов были вычислены по уравнению Вант-Гоффа в интегральной форме [25]:

Изменение энтропии вычислено по формуле:

где ΔH – тепловой эффект реакции, ΔS – энтропия реакции, ΔG – изменение свободной энергии, T – средняя температура, β_k – константа устойчивости.

Общая методика получения комплекса ПК-АК : ПК в количестве 5.5 осново-ммоль растворяли в 20 мл воды. АК в количестве 5.5 ммоль растворяли в 20 мл воды и доводили рН до 7.0. К раствору ПК при интенсивном перемешивании прикапывали раствор АК при комнатной температуре. Реакцию проводили в течение 3 ч. По окончании реакции продукт выделяли осаждением этиловым спиртом, переосаждали снова из воды в спирт, осадок отделяли и промывали 3 раза спиртом, затем диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. Полученные комплексы анализировали на содержание углерода, водорода и азота на анализаторе марки EUKO EA-3000.

ПК–Phe. Выход 83.4%. ИК-спектр, ν, см^–1: 3050–2400 ν(OH), 3390, 3337 ν(N–H), 3049–3028 ν(CH–Ar), 1605 ν(N–H) , 1582 ν(C=O в СОО^–), 1144–1019 ν(С–О, С–С). УФ-спектр, λ_max, нм: 249, 254, 260, 266. Найдено, %: С 52.13; Н 5.81; N 5.01. Вычислено, %: С 53.45; Н 5.75; N 4.02. $\alpha _{{\text{D}}}^{{20}}$, (Н₂О): +144.

ПК–His. Выход 85.6%. ИК-спектр, ν, см^–1: 3127–3560 ν(ОН), 1635 ν(C=O в СОО^–), 1148–1018 ν(С–О, С–С), 1593–1568 ν(N=H), 1085 ν(N–H) УФ-спектр, λ_max, нм: 206. Найдено, %: С 42.83; Н 5.23; N 11.25. Вычислено, %: С 44.38; Н 5.33; N 11.40. $\alpha _{{\text{D}}}^{{20}}$, (Н₂О): +99.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Взаимодействие ПК с АК изучалось методами УФ-, ИК-¹³С ЯМР-спектроскопии, поляриметрии и элементного анализа. Были исследованы спектры поглощения АК и смесей АК с ПК в водных растворах при изменении рН среды. УФ-спектр поглощения молекулы Phe характеризуется серией пиков в виде зубцов, где основной максимум приходится на длину волны 262 нм, а остальные полосы поглощения (ПП) с разной степенью разрешения имеют следующие максимумы 249, 255 и 267 нм (рис. 1). Добавление увеличивающихся количеств ПК к раствору Phe приводит к смещению максимума ПП (262 нм) на 2 нм в коротковолновую область спектра и значительному увеличению ее интенсивности (рис. 1). Необходимо отметить, что характер спектральных изменений слабо зависит от рН: небольшие изменения происходят при проведении реакции в нейтральной и слабощелочной среде (рис. 2).

В УФ-спектре His наблюдается одна интенсивная ПП при 211 нм, которая относится к n-π-переходу шестиэлектронной системы ядра [26]. УФ-спектр водных растворов смеси ПК–His в кислой среде (рН 1.0–3.0) практически идентичен спектру His в этих же условиях с незначительным гипсохромным сдвигом полосы поглощения (1 нм), что говорит о слабом взаимодействии при данных значениях рН (рис. 2). Спектральные изменения в растворах наблюдаются, начиная с рН > 4.0, и сопровождаются гиперхромным эффектом и сдвигом полосы поглощения смеси ПК–His в коротковолновую область спектра на 5 нм (рис. 3). Данные изменения в спектрах систем ПК–Phe и ПК–His, согласно [27], могут быть объяснены образованием комплексных соединений.

Состав и константу устойчивости образующихся комплексов определяли методами изомолярных серий и мольных отношений при рН 7.0 (табл. 1). Согласно полученным обоими методами результатам, ПК образует с АК комплексы состава 1 : 1. Из табл. 1 видно, что устойчивость комплексов прежде всего зависит от строения АК и температуры процесса. Очевидно, присутствие различных по своему характеру функциональных групп в боковой цепи аминокислот обусловливает изменение эффективного заряда на атоме азота амино-группы, что приводит к перераспределению электронной плотности на данном атоме и отражается на устойчивости образующихся комплексов. Так, для системы ПК–Phe значения величин констант устойчивости, полученные для различных температур, имеют одинаковый порядок и невелики. Тогда как комплекс ПК–His оказался примерно в 20–50 раз более устойчивым, чем ПК–Phe, что обусловлено строением молекулы гистидина, в состав которой входит имидазольное кольцо, в котором атомы азота отличаются электронным окружением. Это влияет на их участие в процессе комплексообразования и может приводить к дополнительной стабилизации комплексного соединения.

Данные ИК-спектров подтверждают это предположение. В ИК-спектре ПК–His по сравнению со спектрами нативного пектина и His наблюдаются следующие изменения: резко уменьшается интенсивность ПП в области 3150–3560 см^–1, характерных для ПП ν(О–Н) и при 1741 см^–1 для ПП ν(С=О) пектина. Кроме того, исчезают ν(N–H)-связи в области 3125–3004 см^–1, уменьшается интенсивность ПП δ (N–H) при 1087 см^–1, тогда как интенсивность и положение ПП ν(СОО^–) His при 1635 см^–1 практически не изменяется. По данным ИК-спектров, в первую очередь, можно предположить, что в координации с полисахаридом участвует азот в положении 3 гетероциклического кольца, о чем свидетельствуют наблюдаемые максимальные изменения в области деформационных колебаний N=CH-фрагмента (1572 см^–1) кольца His, ПП которого сдвигается до 1593 см^–1. Нельзя исключить и дополнительное связывание кислородсодержащих групп ПК с амино-функцией His, что подтверждается сглаживанием полос поглощения ⁺NН₃-группы аминокислоты в области 2300–2800 см^–1.

В спектре комплекса ПК–Phe ПП ν(С=О) при 1741 см^–1 пектина уменьшается, также уменьшается интенсивность и происходит низкочастотный сдвиг ПП ν(–ОН) в области 3050–2400 см^–1 и высокочастотный сдвиг ν(–С–О–С) пиранозного кольца в области 1019–1144 см^–1. Подтверждением участия амино-функции Phe в комплексообразовании является изменение характера ИК-спектра в области 2400–3600 см^–1. Исчезают характерные ПП ν(⁺NН₃), появляется ПП ν(N–H) при 3337 см^–1, а ПП ν(N–H) при 1626 см^–1 сдвигается до 1605 см^–1.

Таким образом, в системах ПК-АК имеет место взаимодействие достаточно сложного характера, учитывая возможность образования различных типов координационных связей у компонентов. Очевидно, формирование комплексов ПК-АК протекает через координацию одной молекулы аминокислоты и одного углеводного звена полисахарида с образованием между ними межмолекулярных связей с участием кислородсодержащих функциональных групп основной цепи пектина и азотсодержащих групп АК.

Спектры ЯМР ¹³С также подтверждают координацию карбонильных групп пектина с азотсодержащими группами АК (табл. 2). Так, при взаимодействии ПК с Phe в спектре ¹³С ЯМР наблюдается незначительный сдвиг сигналов всех атомов углеродов ароматического кольца на 0.01–0.03 м.д. Наиболее значительное смещение на 0.05 м.д. можно отметить для атома углерода С8 непосредственно связанного с амино-функцией Phe. Из совокупности спектральных данных следует, что ароматическое кольцо Phe не принимает непосредственного участия в комплексообразовании, но изменяется характер ауксохрома у Ar, приводя к существенному гиперхромному эффекту при незначительном гипсохромном сдвиге в электронных спектрах ПК–Phe. Изоэлектрическая точка (pl) Phe равна 5.5, вследствие этого в кислой и слабокислой среде атом азота находится в кватернизированной форме, что снижает его способность к комплексообразованию. В условиях эксперимента при рН 7.0 количество свободной NH₂-группы увеличивается и за счет нее образуется малоустойчивый комплекс, структуру которого можно представить следующей схемой:

Как видно из приведенных в табл. 2 данных хим. сдвиги всех ядер ¹³С His смещаются в сторону высокого поля. Изменения хим. сдвигов для С2 и С5 гетероцикла His (Δδ = 0.12, 0.05 м.д. соответственно) говорят о координации за счет азота в третьем положении гетероцикла с карбонильной группой полисахарида. Изменения хим. сдвига для С8 на 0.27 м.д. в сильное поле свидетельствуют о возможной координации СОО^–-группы His, потому что при pl His 7.58, аминокислота существует в виде цвиттер-иона и карбокси-анион вносит вклад в устойчивость комплекса за счет слабого электростатического взаимодействия с гидроксильными группами ПК, как показано на схеме:

По уравнению Вант-Гоффа определены термодинамические параметры процесса комплексообразования. Знак и величина термодинамических параметров, связанных с различными индивидуальными видами взаимодействий в процессах ассоциации с биополимерами, были охарактеризованы в работе [28]. Положительное значение ΔS часто считается свидетельством гидрофобного взаимодействия. Взаимодействие через водородные связи между молекулами характеризуется отрицательными значениями ΔS и ΔН, а электростатическое взаимодействие – положительным значением ΔS. Так, комплексообразование Phe с ПК характеризуется отрицательными значениями изменения энтальпии и энтропии, что может быть связано с ограничениями свободы колебательных и вращательных движений молекулы АК при ее взаимодействии с полисахаридом. Вероятно, в связывании ПК с Phe основную роль играют ван-дер-ваальсовые взаимодействия и водородные связи, причем это связывание контролируется энтальпийной составляющей. Отрицательные значения изменения энергии Гиббса свидетельствуют о самопроизвольной реакции комплексообразования между Phe и ПК. Процессы комплексообразования ПК с His характеризуются отрицательными значениями энтальпии и положительными значениями энтропии, т.е. связывание пектина с аминокислотой является энтальпийно-энтропийно благоприятным (∆H° < 0, ∆S° > 0) (табл. 1). Видимо, в случае комплексообразования ПК с His основной вклад вносят не только электростатические силы и водородные связи, но и гидрофобные взаимодействия.

Синтезированные соединения были выделены путем осаждения спиртом из водного раствора, очищены и исследованы спектральными методами. Все полученные комплексные соединения хорошо растворимы в воде и практически нерастворимы в спирте, ацетоне, эфире. Об изменении качественного состава продуктов комплексообразования также свидетельствует изменение величины удельного угла вращения полученных полимерных комплексов. Продукты взаимодействия ПК с АК имеют удельные углы вращения, существенно отличающиеся от $\alpha _{{\text{D}}}^{{20}}$ исходного полисахарида.

Таким образом, спектральными методами показано образование межмолекулярных комплексов яблочного пектина с аминокислотами – L-фенилаланином и L-гистидином за счет взаимодействия гидроксильных и карбонильных групп полисахарида с амино-функциями АК и дополнительной стабилизации посредством слабых водородных связей. Показано, что образование молекулярных комплексов состава 1 : 1 для системы ПК–Phe контролируется только энтальпийной составляющей (∆H° < 0, ∆S° < 0), а связывание ПК с His энтальпийно-энтропийно благоприятно (∆H° < 0, ∆S° > 0). Полученные результаты подтверждают образование “мягких” комплексов, что принципиально важно при создании лекарственных полимерсодержащих препаратов с быстрым высвобождением действующего компонента из комплексного соединении. Пектины, модифицированные Phe и His могут быть предложены в качестве лекарственных средств пролонгированного действия и активных пищевых добавок.

Статья подготовлена в рамках выполнения программы ФНИ государственных академий на 2013–2020 гг. Гос. задание № АААА-А20-120012090024-5. Анализы (измерения и расчеты) выполнены на оборудовании ЦКП “Химия” УфИХ РАН и РЦКП “Агидель” УФИЦ РАН.