Физиология растений, 2019, T. 66, № 1, стр. 35-45

ВВЕДЕНИЕ

Культуры клеток растений in vitro являются удобными системами для выяснения особенностей вторичного метаболизма и используются для получения биологически активных веществ [1–3]. Среди достоинств культивирования in vitro – преодоление сезонных и географических ограничений, возможность масштабирования и промышленного производства ценных биологически активных соединений вторичного синтеза [1, 4]. Однако содержание вторичных метаболитов в стерильных микрорастениях, каллусных и суспензионных культурах чаще всего ниже по сравнению с растениями, произрастающими в естественных условиях. Прежде всего, это может быть связано с функциональной ролью веществ вторичного синтеза. Вторичный метаболизм необходим для существования растения в реальной экологической ситуации, а в условиях in vitro клетки дедифференцируются и выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению [1, 5]. Исследование возможности регуляции синтеза вторичных метаболитов в клеточных культурах является актуальной задачей.

К вторичным метаболитам относятся фенольные соединения, характерные для всех высших растений [1]. Фенольный метаболизм и ростовые характеристики каллусных и суспензионных культур активно изучаются для многих растительных объектов. Достаточно высок интерес к вторичному метаболизму представителей семейства вересковые (Ericaceae Juss.), что объясняется пищевыми, лечебными и декоративными качествами растений. Биохимический анализ ягод и листьев демонстрирует богатство представителей этого семейства фенольными соединениями, обладающими высокой биологической активностью.

Среди наиболее важных и известных ягодных культур семейства вересковые являются клюква болотная (Oxycoccus palustris Pers.) и клюква крупноплодная (O. macrocarpus (Ait.) Pers.). Клюква крупноплодная – это эндемик североамериканского континента, тогда как клюква болотная распространена и в Северной Америке, и в Евразии [6]. Клюква крупноплодная от клюквы болотной отличается размерами (более крупные листья, цветки и ягоды), плоидностью [6], а также рядом биохимических показателей, в т.ч. содержанием фенольных соединений [7, 8]. Закономерен вопрос: будут ли различаться эти виды в культуре in vitro и в чем будут проявляться различия?

Для клюквы крупноплодной имеется ряд исследований фенольного метаболизма в культуре клеток, а для клюквы болотной такие работы единичны [9]. Так, у каллусов клюквы крупноплодной изучалось влияние типа экспланта на накопление антоцианов и других флавоноидов, а также проантоцианидинов [4]. Показано, что максимум накопления антоцианов у каллусов стеблевого происхождения приходился на 12 день культивирования на питательной среде Гамборга с фитогормонами НУК, 2,4-Д и кинетин (Кин) при непрерывном освещении [4]. В другой работе в качестве условий, способствующих накоплению биомассы и синтезу антоцианов у каллусов клюквы крупноплодной, отмечены использование среды WPM с одновременным присутствием фитогормонов α‑нафтилуксусной кислоты (НУК), 2,4-Д, Кин и 6-бензиламинопурина (БАП), повышенным значением pH, а также снижение температуры окружающей среды и освещение красным светом [10]. При этом накопление фенольных соединений и биомассы каллусными культурами клюквы в динамике остаются не охарактеризованными.

Одним из продуктивных биотехнологических подходов для регуляции синтеза вторичных метаболитов является добавление в питательную среду фитогормонов, тип которых должен подбираться для каждого конкретного случая. Для индукции каллусогенеза in vitro необходимо применять одновременно ауксины в сочетании с цитокининами. Ранее нами было показано, что в каллусах клюквы крупноплодной в присутствии ауксина 2,4-Д содержание фенольных веществ ниже, чем в присутствии НУК [11]. В связи с этим в настоящей работе в качестве ауксина мы использовали НУК и варьировали только природой цитокинина. В качестве цитокининов нами были выбраны Кин, БАП и иП; последний широко используется для клонального микроразмножения представителей семейства Вересковые, в т.ч. клюквы крупноплодной [12]. Цель настоящего исследования – сравнить каллусы клюквы болотной и крупноплодной по способности к накоплению биомассы и фенольных соединений в присутствии разных цитокининов в питательной среде.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования явились каллусные культуры клюквы болотной (Oxycoccus palustris Pers.) и крупноплодной (O. macrocarpus (Ait.) Pers., сорт Стивенс). Для получения каллусных культур использовали листья стерильных микрорастений клюквы, размножаемых на питательной среде Андерсона. Инициацию каллусов проводила также на среде Андерсона, дополненной ауксином и цитокинином в концентрациях по 0.5 мг/л. В качестве ауксина использовали НУК, в качестве цитокинина – кинетин (Кин, 6-фурфуриламинопурин), или БАП, или 2-изопентениладенин (иП, 6‑γ,γ-диметилаллиламинопурин). Испытаны сочетания фитогормонов: НУК/Кин, НУК/БАП, НУК/иП. pH среды до автоклавирования – 5. Листья стерильных микрорастений клюквы помещали по 5 штук в сосуды на 100 мл; объем питательной среды – 25 мл. Инициацию каллусов проводили в течение 8 недель на свету (3000 лк, фотопериод – 16/8 ч) при температуре +25°C. После инициациии (т.е. после 0 пассажа) произвели оценку частоты каллусообразования.

Инициированные каллусы пересаживали на свежую питательную среду с тем же гормональным составом и культивировали при таких же температурных условиях и режиме освещения. Длительность культивирования в течение последующих трех пассажей составляла 4 недели; в течение четвертого пассажа – 7 недель, далее – по 5 недель. По окончании исследования общий период культивирования на 12 пассаже составлял 16 месяцев.

После каждого пассажа и еженедельно в течение четвертого пассажа анализировали уровень фенольных соединений. Содержание фенольных соединений в каллусах определяли спектрофотометрически (UV-1700 (Shimadzu, Япония)) и выражали в мг/г сырой массы.

Каллусы фиксировали кипящим 80% этанолом в течение 10 мин. В этанольных экстрактах определяли содержание растворимых фенольных соединений (РФС), флавоноидов и катехинов. Количественный анализ РФС осуществляли по методике, описанной М.Н. Запрометовым [13]. Для этого к 0.5 мл экстракта добавляли 8.55 мл воды, 0.5 мл реактива Фолина-Денис и через 3 мин – 1 мл 7% Na₂CO₃. Через 1 час определяли оптическую плотность при 725 нм.

Анализ содержания флавоноидов проводили согласно методике, приведенной G. Gunes, R.H. Liu и С.B. Watkins [14], по реакции с AlCl₃. Окрашенные растворы спектрофотометрировали при длине волны 510 нм. Для этого к 0.5 мл экстракта добавляли 5 мл воды, 0.3 мл 5% NaNO₂, через 5 мин – 0.3 мл 10% AlCl₃, через 6 мин – 2 мл 1 М NaOH и водой доводили объем до 10 мл. Спектрофотометрировали при длине волны 510 нм.

Содержание РФС и флавоноидов определяли с использованием градуировочных зависимостей, построенных по раствору рутина.

Анализ содержания катехинов проводили согласно методике, описанной М.Н. Запрометовым [13]. Реакционная смесь состояла из 0.25 мл экстракта, 0.15 мл воды и 2 мл ванилинового реактива (1% ванилин в HCl_конц). Через 15 мин определяли оптическую плотность при длине волны 510 нм. Содержание катехинов определяли с использованием градуировочной зависимости, построенной по раствору катехина.

В работе использованы реактивы следующих фирм: НУК – “Serva” (Германия); кинетин – “AppliChem” (Германия); БАП и рутин – “Acros Organics” (Бельгия); иП – “Sigma”, (Швейцария); катехин – “Sigma” (США); ванилин – “Roth” (Германия). Остальные реактивы были отечественного производства, имеющие квалификацию х. ч. или ч. д. а.

В ходе четвертого пассажа также определяли динамику роста каллусных тканей по сырой и сухой биомассе. Высушивание проводили в термостате при 60°C до постоянной массы. Индекс роста выражали величиной отношения разности конечной и первоначальной массы к массе первоначального каллуса (m_i – m₀)/m₀. Работы, связанные с определением массы, проведены в трехкратной повторности; на графиках отражены средние арифметические значения и их стандартные отклонения.

В случаях количественного определения фенольных соединений на графиках представлены средние арифметические значения из трех биологических проб (по 2–5 каллусов; каждая проба выполнена в трех аналитических повторностях), и их стандартные отклонения. Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью программы Microsoft Excel 2010. Достоверность различий определяли, используя коэффициент Стьюдента (статистически значимыми считали различия при р < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Инициированные каллусы клюквы болотной и крупноплодной (табл. 1) имели плотную консистенцию и желтый цвет. Каллусы клюквы крупноплодной были больше по размеру, чем каллусы клюквы болотной, и содержали коричневые участки как внутри, так и на поверхности каллусной ткани.

Таблица 1.

Внешний вид первичных каллусов и частота каллусогенеза у клюквы болотной и крупноплодной

Вид	НУК/Кин	НУК/БАП	НУК/иП
$\left[ {\frac{{^{{}}}}{{_{{}}}}} \right.$Клюква болотная	84%	40%	76%
Клюква крупноплодная	36%	48%	88%

Примечание. Масштаб – 1 см. БАП – 6-бензиламинопурин; иП – 2-изопентениладенин; Кин – кинетин; НУК – α-нафтилуксусная кислота.

Способность к каллусообразованию листовыми эксплантами клюквы болотной и крупноплодной на средах с разными цитокининами была различной (табл. 1). Для клюквы болотной максимальное образование каллусов происходило в присутствии Кин (84%), тогда как для клюквы крупноплодной, наоборот, оно было минимальным (36%). Высокая частота каллусообразования у клюквы крупноплодной наблюдалась в варианте с иП (88%).

Суммарное содержание РФС в инициированных каллусах варьировало в зависимости от гормонального состава среды: у клюквы болотной – в пределах от 6 до 10 мг/г сырой массы, у клюквы крупноплодной – от 8 до 13 мг/г сырой массы (рис. 1). Для каллусов клюквы болотной при выращивании на питательной среде с иП отмечена наибольшая продукция РФС, а для каллусов клюквы крупноплодной – наоборот, наименьшая.

Рис. 1.

Уровень фенольных соединений в каллусах в течение 0, 1, 2 и 3 пассажей. (а) – каллусы клюквы болотной на среде с НУК/Кин; (б) – каллусы клюквы болотной на среде с НУК/БАП; (в) – каллусы клюквы болотной на среде с НУК/иП; (г) – каллусы клюквы крупноплодной на среде с НУК/Кин; (д) – каллусы клюквы крупноплодной на среде с НУК/БАП; (е) – каллусы клюквы крупноплодной на среде с НУК/иП. 1 – растворимые фенольные соединения; 2 – флавоноиды; 3 – катехины. * – уровень фенольных соединений у каллусов клюквы крупноплодной достоверно (р < 0.05) выше, чем у клюквы болотной в тех же условиях культивирования. БАП – 6-бензиламинопурин; иП – 2-изопентениладенин; Кин – кинетин; НУК – α-нафтилуксусная кислота.

Изменение уровня исследуемых фенольных метаболитов после каждого из трех следующих пассажей зависело как от вида клюквы, так и цитокинина в питательной среде. В частности, в присутствии БАП у каллусов обоих видов клюквы содержание РФС, флавоноидов и катехинов неуклонно снижалось, за исключением первого пассажа для каллусов клюквы болотной. Для каллусов клюквы крупноплодной, культивируемых на среде с иП, значительное снижение РФС и флавоноидов отмечено лишь после третьего пассажа. Наиболее стабильный синтез фенольных соединений для каллусов обоих видов клюквы выявлен в присутствии Кин. Доля флавоноидов в фенольном комплексе каллусов клюквы болотной в среднем составляла 62%, а каллусов клюквы крупноплодной – 82%.

В ходе 4 пассажа анализ содержания исследуемых метаболитов в каллусах проводили каждую неделю в течение 7 недель; кроме того, определяли динамику роста по сырой и сухой биомассе. Результаты такого исследования показали, что через неделю после пассирования уровень фенольных соединений становился до 3 раз меньше, чем в конце предыдущего (третьего) пассажа (рис. 1, 2). Затем биосинтетическая способность культур возрастала в 2–3 раза. При этом время максимального накопления фенольных соединений зависело как от типа цитокинина в питательной среде, так и от вида клюквы. Так, в присутствии Кин или иП наблюдался выраженный максимум накопления, в большинстве случаев приходившийся на 5 неделю культивирования. В случае с БАП ярко выраженный пик в накоплении фенольных соединений отмечен не был.

Рис. 2.

Динамика накопления фенольных соединений в каллусах в течение 7 недель одного пассажа. (а) – динамика накопления растворимых фенольных соединений (РФС) в каллусах клюквы болотной; (б) – динамика накопления растворимых фенольных соединений (РФС) в каллусах клюквы крупноплодной; (в) – динамика накопления флавоноидов в каллусах клюквы болотной; (г) – динамика накопления флавоноидов в каллусах клюквы крупноплодной; (д) – динамика накопления катехинов в каллусах клюквы болотной; (е) – динамика накопления катехинов в каллусах клюквы крупноплодной. Цифрами (1–7) обозначены недели пассажа. БАП – 6-бензиламинопурин; иП – 2-изопентениладенин; Кин – кинетин; НУК – α-нафтилуксусная кислота; РФС – растворимые фенольные соединения.

Выявлена различная для каллусов клюквы двух видов реакция на присутствие иП. Содержание всех исследованных групп фенольных соединений – РФС, флавоноидов и катехинов в каллусах клюквы крупноплодной, культивируемых на питательной среде с иП, снижалось на второй и третьей неделе, после чего возрастало (рис. 2б). Подобного снижения для каллусов клюквы болотной не отмечено (рис. 2а).

Содержание фенольных соединений в каллусах клюквы болотной на среде с иП было выше, чем с другими цитокининами, и сопоставимо с таковым в каллусах клюквы крупноплодной. На средах, содержащих в качестве цитокининов Кин и БАП, каллусы клюквы болотной в ходе пассажа накапливали в целом вдвое меньше исследуемых метаболитов, чем каллусы клюквы крупноплодной на этих же средах. Выявленная особенность вторичного синтеза почти всегда распространялась на исследованные группы фенольных соединений: суммарное содержание РФС, содержание флавоноидов и катехинов.

Интересно изменение доли флавоноидов в составе РФС в течение пассажа. У каллусов клюквы крупноплодной она увеличивалась с 65% (первая неделя) до 86% (четвертая неделя), затем снижалась. У каллусов клюквы болотной рассматриваемый показатель имел более сложный характер изменений по неделям: 64% после первой недели, 47% – после второй, 71% – после шестой. В целом, вклад флавоноидов в фенольный комплекс каллусов клюквы болотной был выше на среде с иП, а крупноплодной – с БАП.

В табл. 2 представлен индекс роста каллусов, рассчитанный по их сырой и сухой массе на 5 и 7 неделе культивирования. Наилучший прирост сырой биомассы каллусов отмечен на среде с иП в случае с клюквой болотной и на среде с БАП в случае клюквы крупноплодной. Максимальное увеличение сухой массы каллусов обоих видов происходило на среде с БАП.

Анализ кривых роста каллусных культур показал, что переход каллусных тканей к стационарной фазе роста приходился на 4 неделю (клюква крупноплодная, среда с Кин) или 5–6 неделю (остальные варианты, кроме среды с БАП) (рис. 3). Каллусы обоих видов клюквы в присутствии БАП даже к 7 неделе культивирования не достигали стационарной фазы. Следует добавить, что к 6–7 неделе культивирования все каллусные культуры приобретали коричневую окраску.

Рис. 3.

Динамика накопления сырой биомассы каллусов в течение 7 недель одного пассажа. (а) – каллусы клюквы болотной; (б) – каллусы клюквы крупноплодной. 1 – среда с НУК/Кин; 2 – среда с НУК/БАП; 3 – среда с НУК/иП. БАП – 6-бензиламинопурин; иП – 2-изопентениладенин; Кин – кинетин; НУК – α-нафтилуксусная кислота.

В связи с полученными данными перенос каллусов на свежую питательную среду в дальнейшем осуществляли каждые 5 недель. Результаты анализа содержания РФС, флавоноидов и катехинов после 6, 8, 10 и 12 пассажей позволили выявить следующие особенности накопления исследуемых метаболитов в каллусных культурах. Способность к синтезу фенольных соединений каллусами клюквы болотной за рассматриваемый период практически не менялась (рис. 4). Исключением являлось повышение уровня исследуемых метаболитов после 8 пассажа в присутствии Кин (в 3 раза) и БАП (в 1.5 раза). Способность к синтезу фенольных соединений каллусами клюквы крупноплодной за период 6–12 пассажей снижалась как минимум в три раза (исключение – 12 пассаж для каллусов на среде с Кин). Особенно заметно снижение на примере каллусов, выращенных на среде с иП (более, чем в 9 раз).

Рис. 4.

Уровень фенольных соединений в каллусах в течение 6, 8, 10 и 12 пассажей. (а) – каллусы клюквы болотной на среде с НУК/Кин; (б) – каллусы клюквы болотной на среде с НУК/БАП; (в) – каллусы клюквы болотной на среде с НУК/иП; (г) – каллусы клюквы крупноплодной на среде с НУК/Кин; (д) – каллусы клюквы крупноплодной на среде с НУК/БАП; (е) – каллусы клюквы крупноплодной на среде с НУК/иП. 1 – растворимые фенольные соединения; 2 – флавоноиды; 3 – катехины. * – уровень фенольных соединений у каллусов клюквы крупноплодной достоверно (р < 0.05) выше, чем у клюквы болотной в тех же условиях культивирования. БАП – 6-бензиламинопурин; иП – 2-изопентениладенин; Кин – кинетин; НУК – α-нафтилуксусная кислота.

Доля флавоноидов в фенольном комплексе каллусов клюквы болотной и крупноплодной за 6–12 пассажей в среднем составила 53 и 57% соответственно, что ниже, чем в среднем за 0–3 пассажа.

Сравнение уровня фенольных соединений в каллусах клюквы болотной и крупноплодной, полученных после инициации и после культивирования в течение 12 пассажей, указывает на снижение количества всех исследованных метаболитов в 2–8 раз. В меньшей степени это коснулось суммарного содержания РФС, но сказалось на представленности флавоноидов и катехинов в фенольном комплексе каллусных культур клюквы (уменьшение в 1.2–1.4 раза и 1.5 раза соответственно).

ОБСУЖДЕНИЕ

Говоря о влиянии фитогормонов цитокининовой природы на культуры клюквы болотной и клюквы крупноплодной in vitro, прежде всего, отметим их разное влияние на каллусогенез. Высокую частоту каллусогенеза у клюквы болотной обеспечивало присутствие в питательной среде Кин, а у клюквы крупноплодной – иП (табл. 1). При этом отмеченные варианты культивирования, в большей степени способствовавшие инициации каллусной ткани, давали пониженное накопление фенольных веществ (табл. 1, рис. 1).

В ходе пассажа прирост массы каллусов составил до 470%. Большее накопление сырой биомассы каллусов клюквы болотной обеспечивал вариант культивирования с иП, а каллусов клюквы крупноплодной – БАП (табл. 2). Большее накопление сухой биомассы каллусов обоих видов клюквы обеспечивал вариант культивирования с БАП. При этом обращает на себя внимание непропорциональное увеличение индексов роста по сырой и сухой биомассе. Анализ литературных [15, 16] и собственных данных позволяет заключить, что у каллусов клюквы болотной в присутствии Кин и иП происходило увеличение обводненности ткани. Кин в некоторой степени способствовал накоплению воды и в каллусах клюквы крупноплодной (7 неделя пассажа). В отличие от вышеописанных случаев, на средах с иП и БАП для каллусов клюквы крупноплодной отмечены более высокие индексы по сухой биомассе, нежели по сырой. Принимая во внимание увеличение этих показателей на 7 неделе культивирования по сравнению с 5 неделей, можно предположить, что эти цитокинины у каллусов клюквы крупноплодной стимулировали деление клеток и/или накопление органического вещества.

Присутствие Кин в питательной среде для каллусов клюквы крупноплодной уменьшило длительность фаз роста (переход к стационарной фазе роста на 4 неделе) по сравнению с остальными вариантами культивирования. Подобный эффект Кин также был показан в отношении каллусов чая в работе М.Н. Запрометова и др. [17]. Культуры клюквы, полученные на средах с БАП, наоборот, даже за 7 недель эксперимента не достигали стационарной фазы роста, а находились в фазе линейного роста. БАП проявляет более высокую активность в поддержании роста, чем Кин [18], что было отмечено T. Harada и T. Yakuwa [19] на примере другого представителя семейства Вересковые – голубики щитковой. Авторы наблюдали стимулирующий эффект гормонального сочетания НУК (1–10 мг/л) и БАП (0.1–1 мг/л) на рост гетеротрофных каллусов, культивируемых в течение 10 недель [19].

Рассматривая вопрос о характере накопления биомассы и вторичных метаболитов у каллусных культур в течение пассажа, необходимо отметить, что синтез вторичных соединений, в основном, улучшается при замедлении или остановке роста культуры [5]. Очевидно, что каллусы клюквы в целом не являются исключением: максимум накопления фенольных соединений в них приходился при замедлении роста (к моменту выхода ростовой кривой на плато) (рис. 2, 3). В дальнейшем снижение уровня фенольных соединений могло быть следствием истощения питательной среды [4]. Добавим, что имевшее место снижение содержания фенольных соединений на 2–3 неделях культивирования у каллусов клюквы крупноплодной в варианте с иП можно объяснить привыканием каллусной ткани к питательной среде.

У каллусов клюквы болотной в присутствии иП, по сравнению с другими цитокининами, наблюдались как интенсивный прирост биомассы, так и продукция фенольных соединений. У каллусов клюквы крупноплодной чуть более высокие показатели выявлены в случае среды, содержащей БАП. Отмеченное нами различие в уровне фенольных соединений в каллусах клюквы двух видов в присутствии Кин, БАП и иП может быть опосредовано различным влиянием этих фитогормонов на процессы метилирования/деметилирования ДНК. Известно, что при каллусогенезе изменяется характер метилирования ДНК в сторону его увеличения [20], и это может быть причиной снижения продукции ферментов, в т.ч. ферментов вторичного синтеза. Например, метилирование гена фермента стильбенсинтазы приводило к уменьшению продукции такого фенольного соединения, как резвератрол, в каллусах винограда [21]. При этом для БАП описана деметилирующая активность, как минимум в отношении генов рРНК [22].

При выяснении влияния возраста (длительности пассирования) каллусной ткани на продукцию фенольных соединений нами было зафиксировано снижение содержания РФС, флавоноидов и катехинов в течение первых трех пассажей для клюквы обоих видов, а также в течение 6–12 пассажей для клюквы крупноплодной. Наиболее заметное снижение происходило в присутствии в питательной среде БАП, а также иП. Ослабление образования фенольных соединений отмечалось при длительном выращивании в условиях in vitro одного из штаммов каллусов чайного растения [23], боярышника азароль [24]. Вероятно, такое явление объясняется отбором клеток с низкой способностью к синтезу фенольных соединений, но с повышенной жизнеспособностью [25] и измененным (повышенным) уровнем плоидности клеток [23].

В то же время для ряда каллусных культур других растений отмечено увеличение накопления фенольных соединений по мере пассирования: до 5–7 пассажа у фотомиксотрофных каллусов чая [26], а также до 10 пассажа у каллусов нута бараньего [27] и до 27 пассажа у каллусов рододендрона Ледебура [28]. У каллусов рододендрона японского отмечено увеличение содержания РФС, флаванов, проантоцианидинов лишь до 13 пассажа, в дальнейшем наблюдалось снижение, что позволяло каллусам данного вида длительное время сохранять жизнеспособность, в отличие от каллусов рододендрона Ледебура [28]. Подобный характер накопления фенольных соединений выявлен для каллусных культур двух видов тисса: по мере пассирования у тисса ягодного наблюдалось увеличение содержания РФС (а в дальнейшем – гибель самих культур), тогда как у тисса канадского – уменьшение, начиная с 7 пассажа [25].

Причиной колебаний в продукции тех или иных метаболитов в молодых каллусных культурах, скорее всего, является их генетическая и эпигенетическая нестабильность, т.к. в культуре in vitro изменяется экспрессия генов, нарушается нормальный клеточный цикл в результате поранения и/или использования регуляторов роста [1, 20]. Загоскиной Н.В. [29] установлено, что содержание РФС и флаванов в гетеротрофных каллусах чая почти не менялось лишь после 15–20 пассажа. Для фотомиксотрофных каллусов клюквы болотной стабильность вторичного синтеза наблюдалась, начиная с 6–10 пассажа, причем раньше всего она проявилась у культур, выращенных на среде с иП (рис. 4). В этом случае можно предположить, что уровень синтеза фенольных соединений (около 4 мг РФС/г сырой массы) в каллусных клетках способствует их устойчивой пролиферации и является следствием популяционного контроля развития [5]. У каллусов клюквы крупноплодной за рассматриваемый период культивирования (16 мес.) стабилизация синтеза не произошла, не был достигнут тот уровень, который не изменялся хотя бы на протяжении трех циклов культивирования и который был бы востребован клетками в стерильных условиях и одновременно не ограничивал пролиферацию. Возможно, отсутствие стабилизации в этом случае отчасти могло быть связано с изменением длительности пассажей.

При сравнении двух видов клюквы между собой можно указать на то, что в присутствии Кин и БАП каллусы клюквы болотной накапливали, как правило, меньше фенольных соединений, чем каллусы клюквы крупноплодной (рис. 1, 2, 4). Уровень накопления фенольных веществ в каллусах клюквы (в целом) может быть сопоставим с таковым в каллусах рододендрона [28], чая [2, 15], боярышника [3].

По сравнению с листьями растений открытого грунта биосинтетическая способность к образованию фенольных соединений имеющихся каллусов клюквы болотной и крупноплодной существенно снижена (особенно флавоноидов – до двух порядков), но может быть сопоставима с ягодами [4, 7, 8]. Снижение способности к синтезу фенольных соединений по сравнению с интактными растениями было описано и для каллусов чая [17, 30], боярышника [3], рододендрона [28]. Наоборот, содержание фенольных соединений в каллусных культурах тисса (особенно во время первых циклов культивирования) значительно выше, чем в тканях интактных растений [25].

Доля флавоноидов в фенольном комплексе листьев клюквы крупноплодной выше, чем клюквы болотной [7, 8], и полученные каллусы в течение первых пассажей сохраняли это межвидовое различие, однако в условиях длительного культивирования in vitro оно было нивелировано в результате упрощения вторичного синтеза.

По всей видимости, в отношении накопления фенольных веществ в каллусах существует лимит; избыточное их содержание коррелирует с приобретением культуры коричневой окраски и некротическими явлениями, что говорит о повышении активности оксидаз [27]. Полученные нами результаты по содержанию фенольных соединений в каллусных культурах клюквы вне зависимости от фитогормонального (цитокининового) состава среды и возраста каллусов не превышали определенных значений. В связи с этим представляется вероятным, что концентрация РФС более 11 мг/г сырой массы для каллусов клюквы болотной и более 17 мг/г сырой массы для каллусов клюквы крупноплодной является чрезвычайно высокой и может вызвать остановку роста и/или гибель культур. В целом, в каллусах клюквы болотной диапазон содержания РФС составил 2–11 мг/г сырой массы, флавоноидов – 1–8 мг/г сырой массы, катехинов – от следовых количеств до 4 мг/г сырой массы; в каллусах клюквы крупноплодной – соответственно, 2–17 мг/г сырой массы, от следовых количеств до 15 мг/г сырой массы, от следовых количеств до 7 мг/г сырой массы.

В клеточной культуре образование и накопление вторичных соединений со сложной структурой менее вероятно в силу большого числа специфических этапов их синтеза после “ответвления” от первичного метаболизма [5]. Эту особенность вторичного метаболизма культур in vitro можно проследить на примере флавоноидов, синтез которых совмещает два пути образования фенольных соединений в растительной клетке: ацетатный и шикиматный. По мере пассирования каллусов клюквы нами выявлено снижение представленности флавоноидов (в т.ч. катехинов) в фенольном комплексе, что согласуется с данными, полученными в отношении доли флаванов в каллусах тисса [25] и чая [26]. Таким образом, в каллусных культурах клюквы произошло упрощение вторичного синтеза. Снижение доли флавоноидов, возможно, является следствием слабого развития фотосинтетического аппарата у каллусов из-за использования готового органического углерода питательной среды [30]. Согласно данным литературы, генетическая стабильность каллусных культур может быть достигнута даже через несколько лет после инициации, и только тогда из наиболее перспективных линий рекомендуется получать уже суспензионные культуры [1], поэтому продолжение работ по изучению содержания фенольных соединений в каллусах клюквы остается актуальным и имеет большое фундаментальное и прикладное значение.

В целом, каллусы клюквы болотной и крупноплодной по-разному отвечали накоплением биомассы и фенольных соединений на природу цитокинина. Проведенное исследование дает основание для контроля и направленного биосинтеза фенольных соединений в культуре тканей и клеток клюквы при варьировании гормонального состава среды. С целью получения увеличенного количества фенольных соединений в каллусах клюквы болотной на ранних этапах культивирования (0–1 пассажи) лучше использовать иП, а крупноплодной – БАП. Однако длительное пассирование каллусных культур на среды с этими цитокининами ведет к снижению содержания фенольных соединений. Более стабильное накопление фенольных соединений у каллусов двух видов клюквы обеспечивает наличие Кин в питательной среде.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 16-34-00529 мол_а.