Физиология растений, 2019, T. 66, № 4, стр. 277-285

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время сероводород (H₂S) считается одной из важных газообразных сигнальных молекул в клетках животных и растений [1]. Изучение физиологических эффектов этого газотрансмиттера представляет особый интерес как для познания фундаментальных механизмов формирования адаптивных реакций растений, так и для разработки практических приемов, называемых “праймингом” (priming). Под этим термином понимают индуцирование устойчивости действием сигнальных молекул или их доноров, во многом похожее на естественные процессы закаливания растений и позволяющие им адаптироваться к экстремальным температурам и другим неблагоприятным факторам [2]. Использование сероводорода в качестве праймирующего агента может быть перспективным в связи с наличием его стабильных и относительно недорогих доноров [3].

Несмотря на то, что за последнее десятилетие получен довольно большой объем сведений о стресс-протекторном действии доноров сероводорода на растения, остаются малоисследованными его механизмы, видовые особенности и даже феноменология эффектов при различных стрессовых воздействиях [1, 3]. Так, в ряде работ показано положительное влияние экзогенного сероводорода на устойчивость растений к гипертермии. Установлено уменьшение под влиянием гидросульфида натрия окислительных повреждений клеток табака [4] и растений клубники [5], повышение выживания проростков кукурузы [6] и колеоптилей пшеницы [7] после повреждающего нагрева. Индуцирование сероводородом теплоустойчивости злаковых растений сопровождалось повышением в них активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы – СОД, каталазы – КАТ, гваяколпероксидазы – ГПО), а также пула восстановленных аскорбата и глутатиона [6, 7].

В то же время данных о роли сероводорода в устойчивости растений к низким температурам значительно меньше. Показано транзиторное повышение эндогенного содержания сероводорода и усиление экспрессии генов ключевых ферментов его синтеза – L-/D-цистеиндесульфгидраз – при действии температуры 4°С у растений винограда [8]. Такой же эффект выявлен и у растений арабидопсиса; с использованием мутантов, дефектных по генам цистеиндесульфгидраз, показана роль сероводорода в активации холодочувствительных генов COR15 и CBF3 [9]. У растений огурца показано повышение под влиянием донора сероводорода активности и усиление экспрессии генов нескольких молекулярных форм H⁺-АТФазы плазматической мембраны корней при действии пониженной температуры (10°С) [10]. Среди злаков влияние сероводорода на устойчивость к гипотермии изучено лишь на растениях свинороя пальчатого (Cynodon dactylon L.) [11]. Показано повышение активности антиоксидантных ферментов у этих растений при обработке 500 мкМ NaHS перед воздействием закаливающей температуры 4°С, а также их выживания при последующем промораживании при –10°С.

Известно, что адаптация к гипотермии представляет собой сложный процесс, включающий в себя изменения жирнокислотного (ЖК) состава мембран в пользу остатков ненасыщенных ЖК, накопление криопротекторов, синтез специфических защитных белков, активацию антиоксидантной системы и альтернативного дыхания [12–14]. При этом вклад различных протекторных систем в формирование холодо- и морозоустойчивости растений может различаться в зависимости от видовых особенностей растений. Так, даже среди различных видов культурных злаков выявлены заметные отличия по вкладу отдельных антиоксидантных ферментов и полифункциональных низкомолекулярных протекторов в поддержание гомеостаза при действии холода. Например, для растений ржи характерны значительное накопление пролина и антоцианов, повышенная конститутивная активность пероксидаз, в то время как у растений пшеницы и ячменя происходит более заметное индуцирование холодом СОД и КАТ [15].

В целом, действие сероводорода на устойчивость растений к гипотермии и функционирование их конкретных протекторных систем в условиях действия низких температур до сих пор изучено очень слабо, а работы, в которых бы сравнивалось влияние доноров H₂S на растения разных таксономических групп, вообще отсутствуют. В связи с этим представлялось целесообразным изучить влияние донора сероводорода гидросульфида натрия на устойчивость к гипотермии и процесс холодового закаливания проростков пшеницы и ржи, которые, как было показано ранее [16], отличаются между собой специфическими особенностями функционирования антиоксидантной и осмопротекторной систем.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований использовали этиолированные проростки озимых пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Досконала и ржи (Secale cereale L.) сорта Память Худоерко. Семена в течение 40 мин обеззараживали в 6% растворе пероксида водорода, тщательно многократно промывали дистиллированной водой и затем проращивали в темноте при температуре 20–22°С на фильтровальной бумаге, смоченной очищенной водопроводной водой.

В серии экспериментов по исследованию влияния донора сероводорода на устойчивость проростков к криострессу гидросульфид натрия (NaHS) в концентрациях диапазона 0.025–1 мМ добавляли в среду в начале проращивания семян и на третьи сутки. Через 4 суток этиолированные проростки использовали для биохимических анализов и подвергали промораживанию в камере Danfoss (Нидерланды) в отсутствие света при –5°С в течение 4 ч, снижая температуру со скоростью 1°C/ч. Перед началом промораживания излишки воды на фильтрах под проростками удаляли фильтровальной бумагой. Для оттаивания проростков температуру в камере повышали до 2°С со скоростью 1°С/ч. После этого проростки отращивали в течение 3 суток при 20–22°С и освещенности 6 клк и оценивали их выживание.

В экспериментах по изучению влияния донора сероводорода на развитие морозоустойчивости пшеницы и ржи при закаливании 3-дневные этиолированные проростки обрабатывали NaHS и помещали на 7 суток в холодильную камеру (без освещения) с температурой 2–4°С. Через 3 суток закаливания проростки соответствующих вариантов повторно обрабатывали растворами гидросульфида натрия, добавляя их соответствующие количества на фильтры под проростками. Контрольные проростки в процессе закаливания инкубировали на очищенной водопроводной воде. Оптимальный режим закаливания был установлен ранее [15, 16]. Для сравнения использовали 4-дневные этиолированные проростки, не подвергавшиеся закаливанию (см. выше). Поскольку при низкой температуре развитие проростков замедлялось, 10-дневные закаленные растения были такими же, как 4-дневные контрольные, выращенные при 20–22°С.

Закаленные образцы подвергали промораживанию в отсутствие света при температурах –5° или –9°С в течение 4 ч, снижая температуру со скоростью 1°С/ч. Затем образцы оттаивали и отращивали на свету для оценки выживания, как описано выше.

Суммарное содержание сахаров в проростках анализировали методом Морриса-Роэ с использованием антронового реактива с модификациями, описанными нами ранее [15]. Их количество выражали в мг/г сухой массы. Содержание пролина определяли с использованием нингидринового реактива и выражали в мкмоль/г сухой массы [17]. Для определения содержания антоцианов навески побегов гомогенизировали в 1% растворе HCl в метаноле. После центрифугирования гомогената на центрифуге MPW 350R (“MedInstruments”, Польша) при 8000 g в течение 15 мин определяли оптическую плотность супернатанта при длине волны 530 нм на спектрофотометре СФ 46 (“ЛОМО”, Россия) [18]. Содержание антоцианов выражали в условных единицах как величины A₅₃₀/г сухой массы.

Активность антиоксидантных ферментов – цитозольной СОД (КФ 1.15.1.1), КАТ (КФ 1.11.1.6) и ГПО (КФ 1.11.1.7) – определяли по методикам, описанным ранее [15]. Навески побегов гомогенизировали на холоде в 0.15 М K,Na-фосфатном буфере (pH 7.6) с добавлением ЭДТА (0.1 мМ) и дитиотрейтола (1 мМ). Для анализа использовали супернатант после центрифугирования гомогената при 8000 g в течение 15 мин при температуре не выше 4°С. Активность СОД определяли при pH реакционной смеси 7.6 с использованием метода, основанного на способности фермента конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксидные анионы, которые образуются вследствие аэробного взаимодействия НАД⋅H и феназинметосульфата. Активность КАТ определяли по количеству пероксида водорода, разложившегося за единицу времени. Активность ГПО анализировали, используя в качестве донора водорода гваякол, в качестве субстрата – пероксид водорода. Активность СОД и ГПО выражали в усл. ед./(мг белка мин), активность КАТ – в мкмоль H₂O₂/(мг белка мин). Содержание белка в пробах определяли по Bradford [19], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Интенсивность пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в тканях проростков определяли по количеству продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (в основном малоновый диальдегид – МДА), как описано ранее [15]. Содержание МДА выражали в нмоль/г сухой массы.

Повторность независимых опытов 3–4-кратная при 3–4-кратной в каждом из них. Приведены средние величины и их стандартные ошибки. Достоверность различий между вариантами определяли по t-критерию Стьюдента. Кроме оговоренных случаев, обсуждаются различия, достоверные при P ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание низкомолекулярных протекторов

Обработка незакаленных проростков пшеницы донором сероводорода в концентрациях 0.1 и 0.5 мМ способствовала повышению в них содержания сахаров (рис. 1а). Закаливание вызывало почти двукратное увеличение суммарного количества растворимых углеводов в побегах. При этом сочетание закаливания проростков с обработкой NaHS способствовало дополнительному их накоплению, особенно эффективным было действие гидросульфида натрия в концентрации 0.5 мМ.

Рис. 1.

Содержание сахаров (а), пролина (б) и антоцианов (в) в проростках пшеницы и ржи при действии донора сероводорода и холодового закаливания (7 суток при 2–4°С). 1 – контроль; 2 – NaHS (0.1 мМ); 3 – NaHS (0.5 мМ); 4 – закаливание; 5 – закаливание + NaHS (0.1 мМ); 6 – закаливание + + NaHS (0.5 мМ). Одинаковыми латинскими буквами для каждого вида по отдельности отмечены значения, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

Побеги проростков ржи отличались более высоким содержанием сахаров (рис. 1а). Обработка проростков донором сероводорода при обычной температуре способствовала повышению их содержания. При закаливании их количество также существенно увеличивалось, а обработка 0.1 и 0.5 мМ NaHS вызывала дополнительное накопление сахаров в побегах проростков ржи.

Под влиянием обработки проростков пшеницы гидросульфидом натрия при обычной температуре повышалось содержание пролина (рис. 1б). Еще более существенно его количество в побегах увеличивалось после закаливания при 2–4°C. Сочетание закаливания с обработкой донором сероводорода вызывало повышение содержания пролина до 40–43 мкмоль/г сухой массы, что более чем в 2.5 раза превышало значения контроля.

Базовое содержание пролина в проростках ржи было более высоким, чем в проростках пшеницы (рис. 1б). Обработка NaHS в обычных условиях индуцировала существенное увеличение его количества. Закаливание вызывало трехкратное повышение содержания пролина, а в вариантах с сочетанием действия низких положительных температур и гидросульфида натрия оно составляло 86–100 мкмоль/г сухого вещества и превышало значения контроля приблизительно в 4 раза.

Под влиянием донора сероводорода в проростках пшеницы увеличивалось содержание антоцианов (рис. 1в). Закаливание также способствовало их накоплению в побегах. При сочетании воздействия закаливающих температур и NaHS отмечалось наиболее высокое содержание антоцианов, которое двукратно превышало значения контроля.

Проростки ржи отличались значительно большим содержанием антоцианов в побегах по сравнению с проростками пшеницы (рис. 1в). Однако их обработка гидросульфидом натрия не вызывала достоверного изменения количества антоцианов. После закаливания отмечалось повышение содержания этих пигментов, при этом величины в вариантах с сочетанием действия низких температур с обработкой донором сероводорода не отличались от таковых с влиянием только закаливания. Таким образом, донор H₂S не оказывал существенного влияния на содержание антоцианов в проростках ржи ни в обычных температурных условиях, ни при закаливании.

Активность антиоксидантных ферментов

Базовая активность СОД у проростков пшеницы была выше, чем у ржи (рис. 2а). При обработке донором сероводорода активность СОД в проростках пшеницы в обычных температурных условиях существенно не изменялась. Закаливание вызывало небольшое, но достоверное при P ≤ 0.05 повышение активности фермента. При этом обработка NaHS, как и в обычных условиях, не вызывала заметных изменений активности СОД.

Рис. 2.

Активность СОД (а), КАТ (б) и ГПО (в) в проростках пшеницы и ржи при действии донора сероводорода и холодового закаливания (7 сут при 2–4°С). 1 – контроль; 2 – NaHS (0.1 мМ); 3 – NaHS (0.5 мМ); 4 – закаливание; 5 – закаливание + NaHS (0.1 мМ); 6 – закаливание + NaHS (0.5 мМ). Одинаковыми латинскими буквами для каждого вида по отдельности отмечены значения, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

У проростков ржи под влиянием гидросульфида натрия в обеих концентрациях активность СОД также изменялась незначительно (рис. 2а). Закаливание вызывало лишь тенденцию к увеличению активности фермента. Однако при сочетании действия закаливающих низких температур и донора сероводорода активность СОД была достоверно выше, чем в контроле.

Конститутивная активность каталазы у проростков пшеницы была несколько выше, чем у проростков ржи (рис. 2б). Под влиянием обработки гидросульфидом натрия и низкотемпературного закаливания в побегах проростков пшеницы повышалась активность КАТ. Комбинированное действие закаливания и донора сероводорода вызывало тенденцию к дополнительному увеличению активности фермента, однако ее значения в этих вариантах достоверно не отличались от величин варианта только с закаливанием.

У проростков ржи также происходило повышение активности КАТ под влиянием донора сероводорода и закаливания (рис. 2б). При сочетании низкотемпературного воздействия с обработкой 0.1 или 0.5 мМ NaHS отмечалось достоверное дополнительное повышение активности фермента.

Обработка проростков пшеницы гидросульфидом натрия в обеих исследуемых концентрациях вызывала небольшое, но достоверное при P ≤ 0.05 повышение активности ГПО в побегах (рис. 2в). Низкотемпературное закаливание оказывало более существенное влияние на активность фермента. При комбинации закаливания и обработки проростков NaHS (особенно в концентрации 0.5 мМ) отмечалось дополнительное увеличение активности ГПО.

Конститутивные величины активности ГПО у проростков ржи значительно превышали таковые у проростов пшеницы (рис. 2в). Под влиянием донора сероводорода происходило повышение активности фермента. Закаливание вызывало двукратное увеличение активности ГПО в проростках ржи, а его сочетание с обработкой NaHS в обеих концентрациях приводило к еще большему повышению ферментативной активности.

ОБСУЖДЕНИЕ

Обработка проростков пшеницы и ржи донором сероводорода гидросульфидом натрия сама по себе вызывала повышение их устойчивости к низким температурам, а в условиях холодового закаливания способствовала дополнительному приросту морозоустойчивости (табл. 1). Криорезистентность двух злаков наиболее существенно повышалась при действии NaHS в концентрациях 0.1 и 0.5 мМ. При этом, однако, в отсутствие закаливания влияние донора сероводорода на устойчивость проростков пшеницы было более существенным по сравнению с таковым на резистентность проростков ржи.

Под влиянием обработки донором сероводорода не только повышалось выживание проростков пшеницы и ржи после действия отрицательных температур, но и снижалась степень проявления окислительных повреждений в первые сутки после промораживания, определяемая по содержанию продукта ПОЛ МДА (табл. 2). Такие результаты в целом согласуются с данными, полученными на растениях свинороя [11].

Уменьшение окислительных повреждений проростков пшеницы и ржи при криострессе в результате их предварительной обработки NaHS указывает на активацию сероводородом антиоксидантной системы. И действительно, в проростках обоих видов происходило повышение активности КАТ и ГПО как при действии только донора сероводорода, так и при его сочетании с закаливанием (рис. 2). При этом проявлялись некоторые видовые особенности. У проростков ржи базовый и индуцированный холодом уровень активности ГПО был значительно выше, чем у пшеницы, более выраженной у закаленных проростков ржи была и реакция этого фермента на обработку донором сероводорода (рис. 2в).

В отличие от ГПО и КАТ, активность СОД под влиянием обработки донором сероводорода существенно не изменялась у обоих видов злаков как при обычной температуре, так и на фоне холодового закаливания (рис. 2а). Следует отметить, что активность СОД повышалась при обработке донором сероводорода зеленых растений пшеницы в нормальных условиях и на фоне засухи [20]. У растений винограда показано повышение активности СОД под влиянием обработки NaHS в условиях действия пониженной температуры [8]. Можно предположить, что влияние сероводорода на протекторные системы зеленых и этиолированных объектов несколько отличается. В случае с этиолированными проростками злаков экзогенный сероводород, очевидно, оказывает влияние на другие компоненты антиоксидантной системы, обезвреживающие радикальные АФК, в частности, на содержание низкомолекулярных антиоксидантов (см. ниже).

Следует отметить, что влияние доноров сероводорода на активность и экспрессию генов антиоксидантных ферментов в настоящее время зарегистрировано на многих объектах и при различных типах стрессов. Так, повышение устойчивости растений свинороя к действию холода, вызываемое донором сероводорода, сопровождалось увеличением активности КАТ, пероксидазы и глутатионредуктазы [11]. У растений люцерны под влиянием обработки донором сероводорода, индуцирующей развитие солеустойчивости, не только повышалась активность, но и усиливалась экспрессия генов Cu/Zn-СОД, КАТ, различных форм пероксидазы [21].

В условиях наших экспериментов особенно заметным было влияние донора сероводорода на содержание полифункциональных низкомолекулярных соединений, выполняющих и роль антиоксидантов. Так, при обработке NaHS в проростках пшеницы и особенно ржи существенно повышалось содержание сахаров, как в обычных условиях, так и на фоне холодового закаливания (рис. 1а). Сахара, как известно, относятся к ключевым криопротекторам, при этом они могут проявлять и антиоксидантное действие. Более того, предполагается, что сахара как антирадикальные агенты могут функционально заменять СОД [22]. Примечательно, что в наших опытах донор сероводорода, повышая содержание сахаров (рис. 1а), не оказывал положительного влияния на активность СОД (рис. 2а).

Другим важным полифункциональным защитным соединением является пролин. Сообщается о связи между накоплением пролина и морозоустойчивостью растений разных видов [15, 23]. В наших экспериментах обработка донором сероводорода проростков обоих злаков вызывала повышение в них содержания пролина как при обычной температуре, так и при закаливающей. При этом влияние обработки NaHS на содержание пролина у ржи было более существенным (рис. 1б). Вероятно, действие донора сероводорода на содержание пролина зависит от видовых особенностей растений. В некоторых работах даже показано снижение содержания пролина при обработке растений донором H₂S. В частности, такие эффекты зарегистрированы у растений огурца в условиях солевого стресса [24] и у проростков шпината при засухе [25]. С другой стороны, у растений пшеницы, обработанных NaHS, содержание пролина в условиях почвенной засухи повышалось более существенно по сравнению с необработанными [20]. По-видимому, неоднозначность влияния сероводорода на содержание пролина может быть обусловлена сложным функциональным взаимодействием этого низкомолекулярного протектора с другими компонентами антиоксидантной системы, вклад которых в защитные процессы также может быть различным в зависимости от вида и физиологического состояния растений. Например, известно, что между активностью СОД и накоплением пролина, как и накоплением сахаров, у растений может проявляться реципрокная зависимость [26].

Еще одним важным протекторным компонентом, содержание которого повышалось в условиях наших экспериментов под влиянием донора сероводорода, являются антоцианы. Их количество при обработке NaHS в обычных и закаливающих условиях заметно повышалось у проростков пшеницы, обладающих низким базовым содержанием этих соединений (рис. 1в). В то же время у проростков ржи, содержавших в несколько раз больше антоцианов, индуцирования их накопления донором сероводорода не наблюдали. Ранее нами было показано значительное повышение содержания антоцианов в зеленых листьях пшеницы под влиянием обработки NaHS перед засухой [20]. В целом же действие сероводорода на накопление флавоноидных соединений пока изучено очень слабо. Помимо результатов, полученных на растениях пшеницы, имеются данные о повышении под влиянием обработки NaHS содержания антоцианов в листьях ячменя при действии УФ-В [27]. Также недавно было показано повышение под действием NaHS общего содержания флавоноидов и количества антоцианов при низкотемпературном хранении плодов боярышника [28].

Следует отметить, что по антиоксидантной активности антоцианы превосходят такие известные антиоксиданты, как аскорбат и α-токоферол [29]. Несмотря на сомнения по поводу значительного вклада антоцианов в антиоксидантную защиту in vivo, связанные с преимущественно вакуолярной локализацией этих пигментов [29], есть данные, указывающие на их значительную роль в холодовой адаптации. Так, показано, что у мутантных растений арабидопсиса, не содержащих антоцианов, при действии низких температур окислительные повреждения были значительно сильнее, чем у обычных растений [18]. При холодовой адаптации выявлено большее накопление флавоноидных соединений у морозоустойчивого сорта пшеницы по сравнению с неморозоустойчивым [30].

Вполне естественно, что сероводород с участием других сигнальных посредников может оказывать влияние не только на накопление низкомолекулярных протекторов и состояние антиоксидантной системы, но и на многие другие физиологические процессы, от которых зависит свойство морозоустойчивости. Так, H₂S вместе с АФК и оксидом азота вовлекается в сложные процессы тиольных модификаций многих белков, в том числе регуляторных [3]. Имеются сведения о повышении под влиянием донора сероводорода активности и экспрессии генов H⁺-АТФазы плазматической мембраны у растений огурца при гипотермии [10], что препятствует подкислению цитоплазмы, вызываемому действием стресс-фактора.

В нашей работе впервые сопоставлено влияние донора сероводорода NaHS на базовую и индуцированную закаливанием устойчивость проростков пшеницы и ржи к криострессу. Показано, что положительное влияние экзогенного сероводорода на морозоустойчивость сопровождается активацией под его влиянием отдельных компонентов антиоксидантной системы и накоплением полифункциональных протекторов. Особенно заметным было влияние донора сероводорода на накопление сахаров и пролина у проростков обоих видов злаков и антоцианов у пшеницы. В целом положительное влияние донора сероводорода было более существенным на проростки пшеницы, обладающие меньшей устойчивостью по сравнению с проростками ржи. Можно предположить, что сероводород, как сигнальная молекула, активирует экспрессию большего числа генов, причастных к свойству морозоустойчивости, у растений, у которых слабее функционируют системы, обусловливающие их резистентность. Естественно, это предположение выходит далеко за рамки полученных экспериментальных данных и требует специальных исследований влияния сероводорода не только на антиоксидантную и осмопротекторную, но и другие защитные системы, составляющие свойство криоустойчивости. В этом контексте также представляет интерес исследование возможных видовых особенностей синтеза эндогенного сероводорода при адаптации злаков к гипотермии и других стрессорам.