Физиология растений, 2019, T. 66, № 5, стр. 375-383

ВВЕДЕНИЕ

Понижение температуры до низких положительных, а иногда и отрицательных значений в период активной вегетации является одним из внешних факторов, оказывающих сильное отрицательное воздействие на рост, развитие и продуктивность растений. Неслучайно большой интерес к механизмам ответной реакции растений на холодовой стресс сохраняется на протяжении многих лет, и к настоящему времени по этому вопросу накоплено значительное количество различных наблюдений и экспериментальных данных. Их анализ показывает, что под влиянием низких субповреждающих (закаливающих) температур в клетках и тканях растений происходят многочисленные структурно-функциональные изменения, особенно хорошо выраженные у холодостойких культур, благодаря которым они приобретают более высокую устойчивость и возможность сохранять свою жизнеспособность в условиях холодового стресса [1, 2]. Среди многочисленных физиолого-биохимических изменений наиболее важными считаются изменения, направленные на поддержание целостности клеточных мембран, сохранение фотосинтетической активности растений и их водного баланса. При этом установлено, что протекание процесса холодовой адаптации растений зависит не только от интенсивности и длительности действия низкой температуры, но и от изменения сопутствующих факторов внешней среды. Например, снижение содержания воды в почве отрицательно сказывалось на способности к холодовой адаптации растений капусты [3], а повышение интенсивности света – на протекание этого процесса у проростков кукурузы [4]. У дуба монгольского понижение температуры до 4°С при высокой концентрации в окружающей среде СО₂ приводило к гораздо более сильному замедлению скорости фотосинтеза, чем при его обычном содержании [5]. У овсяницы луговой, наоборот, низкотемпературное воздействие в условиях двухкратного увеличения концентрации СО₂ усиливало интенсивность фотосинтеза, хотя в обычных условиях скорость процесса снижалась [6]. В ряде работ указывается, что на адаптацию растений к низким температурам значительное влияние оказывают условия минерального питания, в частности, содержание в почве макро- и микроэлементов [7, 8], однако такого рода данные немногочисленны. В большинстве же случаев исследование процесса низкотемпературной адаптации проводится в условиях сбалансированного минерального питания. Вместе с тем, в настоящее время во многих странах мира весьма остро стоит проблема загрязнения территорий, используемых для выращивания сельскохозяйственных растений, тяжелыми металлами, в том числе цинком. Увеличение содержания цинка в почве и растениях связано с выбросами промышленных предприятий, а также в значительной степени с использованием высоких доз цинксодержащих минеральных удобрений и средств защиты растений от болезней [9]. В небольших концентрациях цинк необходим для нормальной жизнедеятельности растений, но его высокие концентрации в почве могут приводить к многочисленным изменениям и/или нарушениям физиологических процессов [10, 11]. Практически неизвестно, как это сказывается на способности растений к низкотемпературной адаптации. Можно предположить, что при избытке цинка в корнеобитаемой среде растения будут хуже адаптироваться к гипотермии вследствие ингибирующего действия металла на основные физиологические процессы. Не исключено, однако, и обратное, что растения, адаптированные к одному стрессору, будут проявлять более высокую устойчивость к другому виду стрессового воздействия.

Цель работы – изучение способности озимой пшеницы к холодовой адаптации в условиях избыточного содержания цинка в корнеобитаемой среде.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Московская 39 выращивали в камере искусственного климата при температуре 22°С, относительной влажности воздуха 60–70%, ФАР 100 мкмоль/(м² с), 14-часовом фотопериоде, на питательном растворе Хогланда-Арнона с оптимальным (вариант 22°С + Zn 2 мкМ) или избыточным (вариант 22°С + Zn 1000 мкМ) содержанием цинка. Концентрация цинка 1000 мкМ, выбранная на основе предварительных опытов, является для этого сорта пшеницы субповреждающей. Спустя 7 суток (исходный уровень) одну часть растений обоих вариантов переносили в климатическую камеру с температурой 4°С, являющуюся для озимой пшеницы закаливающей, а другую их часть оставляли в прежних условиях. В исходной точке, а также через 1 и 3 суток у растений всех вариантов измеряли показатели, характеризующие рост (высоту побега, его сырую и сухую биомассу), состояние фотосинтетического аппарата (содержание фотосинтетических пигментов, фотохимическую активность ФС II, устьичную проводимость и интенсивность фотосинтеза) и водный обмен (интенсивность транспирации и оводненность тканей побега). Изучали также устойчивость клеток листьев пшеницы к промораживанию. На протяжении опыта анализировали содержание в органах растений ионов цинка.

Фотосинтетические пигменты экстрагировали 80% ацетоном, их концентрацию определяли на спектрофотометре СФ-2000 (“ОКБ Спектр”, Россия) используя длины волн 665 и 649 нм для измерения содержания хлорофиллов и 440.5 нм для определения количества каротиноидов. Потенциальный квантовый выход фотохимической активности ФС II (F_v/F_m) измеряли после 20-минутной темновой адаптации листьев с помощью флуориметра MINI-PAM (“Walz”, Германия). Устьичную проводимость, интенсивность фотосинтеза и транспирации анализировали с помощью портативной системы для исследования СО₂-газообмена и водяных паров HСM-1000 (“Walz”, Германия). Все измерения проводили на первом листе, считая от основания побега. Содержание цинка в побегах измеряли на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА-7000 (“Shimadzy”, Япония). Холодоустойчивость растений оценивали по температуре гибели 50% палисадных клеток (ЛТ₅₀) листовых высечек после их промораживания в термоэлектрическом термостате ТЖР-02/-20 (“Интерм”, Россия) при последовательном снижении температуры с шагом 0.4°С. Жизнеспособность клеток определяли с помощью светового микроскопа Микмед-2 (“ЛОМО”, Россия) по коагуляции цитоплазмы и деструкции хлоропластов.

В каждом варианте опыта измерения проводили на 6–12 растениях (биологическая повторность) в зависимости от показателя. Аналитическая повторность для определения содержания фотосинтетических пигментов и количества цинка в побегах растений была 3–4-кратной. Весь опыт повторяли дважды. На рисунках и в таблицах представлены средние значения по двум независимым опытам и их стандартные ошибки. Анализ данных проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа.

Исследования выполнены на оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенные исследования показали, что после 7-суточной экспозиции (исходный уровень) озимой пшеницы на растворе с цинком в концентрации 1000 мкМ проростки характеризовались меньшими высотой и сырой биомассой побега по сравнению с растениями, находящимися при оптимальном содержании цинка в корнеобитаемой среде (табл. 1). В дальнейшем при температуре 22°С ингибирующий эффект металла в отношении указанных показателей сохранялся, однако полной остановки роста растений не происходило. Более того, в этих условиях избыток цинка практически не оказывал выраженного отрицательного влияния на накопление сухой биомассы побега. При воздействии температуры 4°С рост побега тормозился, причем независимо от содержания металла в питательном растворе, тогда как его сухая биомасса продолжала увеличиваться и через 3 суток превышала исходный уровень на 28 и 26% при оптимальном и избыточном содержании цинка, соответственно.

Цинк в высокой концентрации вызывал замедление скорости фотосинтеза у проростков пшеницы, и после недельной экспозиции на растворе с металлом (исходный уровень) скорость поглощения СО₂ в этом варианте опыта была на 20% ниже, чем в варианте с оптимальным его содержанием (рис. 1), однако спустя еще 3 суток при температуре 22°С эти различия сглаживались. Воздействие на проростки температуры 4°С уже через 1 сутки приводило к резкому (почти в 5 раз по сравнению с исходным уровнем) снижению скорости фотосинтеза. Тем не менее, через 3 суток при оптимальном содержании цинка скорость процесса вновь несколько возрастала, тогда как при его высокой концентрации продолжала снижаться.

Рис. 1.

Влияние температуры 4°С на скорость фотосинтеза у растений пшеницы сорта Московская 39 при оптимальной (2 мкМ) и высокой (1000 мкМ) концентрации цинка в корнеобитаемой среде. 1 – исходный уровень; 2 и 3 – 1 и 3 суток воздействия температуры 4°С, соответственно. Различные прописные буквы обозначают достоверные различия между вариантами, строчные буквы – в зависимости от времени экспозиции при P < 0.05.

Одной из возможных причин замедления скорости фотосинтеза у растений в неблагоприятных условиях среды является уменьшение содержания фотосинтетических пигментов. В наших опытах после 7-суточной экспозиции на растворе с избытком цинка (исходный уровень) концентрация хлорофиллов была на 10%, а каротиноидов – на 20% ниже, чем в варианте с его оптимальным содержанием, и при температуре 22°С эти различия сохранялись на протяжении последующих 3 суток (табл. 2). При воздействии 4°С на растения, находящиеся в условиях оптимального содержания цинка, концентрация хлорофиллов и каротиноидов, наоборот, заметно увеличивалась уже спустя 1 сутки и в дальнейшем сохранялась на высоком уровне. В отличие от этого, при избытке цинка низкая температура приводила к снижению содержания зеленых пигментов в листьях проростков, но практически не сказывалась на содержании каротиноидов.

К замедлению фотосинтеза могли привести и изменения, затрагивающие световые реакции этого процесса. В частности, величина показателя F_v/F_m у проростков пшеницы в присутствии цинка в концентрации 1000 мкМ на протяжении всего опыта была несколько ниже, чем при его оптимальной концентрации (табл. 2). Низкая температура также приводила к некоторому снижению у растений этого показателя, более явно выраженному при высоком содержании металла в корнеобитаемой среде. В целом, однако, можно говорить об отсутствии во всех вариантах опыта ярко выраженных нарушений в работе фотосистемы II.

Еще одним важным фактором, влияющим на скорость СО₂-ассимиляции, является устьичная проводимость. У проростков, находящихся в течение 7 суток в условиях избытка цинка (исходный уровень), устьичная проводимость заметно уменьшалась, что, вероятно, было одной из причин замедления скорости фотосинтеза (рис. 2). Однако в дальнейшем при 22°С этот показатель вновь повышался, свидетельствуя о восстановлении скорости ассимиляции СО₂. Низкая температура приводила к значительному (почти в 3 раза по сравнению с исходным уровнем) уменьшению устьичной проводимости уже через 1 сутки воздействия, но при оптимальном содержании металла спустя 3 суток наблюдалось частичное восстановление этого параметра, тогда как при его избытке это не происходило.

Рис. 2.

Влияние температуры 4°С на устьичную проводимость у растений пшеницы сорта Московская 39 при оптимальной (2 мкМ) и высокой (1000 мкМ) концентрации цинка в корнеобитаемой среде. 1 – исходный уровень; 2 и 3 – 1 и 3 суток воздействия температуры 4°С, соответственно. Различные прописные буквы обозначают достоверные различия между вариантами, строчные буквы – в зависимости от времени экспозиции при P < 0.05.

Известно, что закрытие устьичной щели в ответ на действие неблагоприятной температуры является защитной реакцией растений, направленной на уменьшение потери воды и сохранение необходимого уровня оводненности тканей. В нашем исследовании скорость транспирации во всех вариантах опыта изменялась аналогично изменению устьичной проводимости (табл. 3), и наиболее сильное снижение интенсивности этого процесса зафиксировано также спустя 3 суток воздействия низкой температуры на проростки, находящиеся в условиях избытка цинка. Отметим, что только в этом варианте опыта наблюдалось заметное уменьшение оводненности тканей побега, свидетельствовавшее о нарушении водного обмена.

Оценка холодоустойчивости клеток листьев показала некоторое ее повышение спустя 1 сутки воздействия температуры 4°С, причем как у проростков, находящихся при оптимальном содержании цинка в питательном растворе, так и у испытывающих его избыток (рис. 3). Спустя 3 суток холодоустойчивость продолжала увеличиваться, но в варианте опыта с оптимальным содержанием металла ее прирост был выше, чем у растений в варианте с его избытком. У проростков, находящихся при 22°С, холодоустойчивость листьев не изменялась.

Рис. 3.

Влияние температуры 4°С на холодоустойчивость листьев пшеницы сорта Московская 39 при оптимальной (2 мкМ) и высокой (1000 мкМ) концентрации цинка в корнеобитаемой среде. 1 – исходный уровень; 2 и 3 – 1 и 3 суток воздействия температуры 4°С, соответственно. Различные прописные буквы обозначают достоверные различия между вариантами, строчные буквы – в зависимости от времени экспозиции при P < 0.05.

Поскольку ответная реакция растений на действие тяжелых металлов во многом определяется их концентрацией в органах, нами был проведен анализ содержания цинка в побегах проростков пшеницы, который показал, что после 7 суток экспозиции растений в условиях избытка металла (исходный уровень) его концентрация оказалась в 40 раз выше, чем у растений, находящихся при оптимальной концентрации цинка в корнеобитаемой среде (табл. 4). В течение следующих 3 суток заметных изменений в содержании металла ни в одном из вариантов опыта не наблюдалось.

Для оценки влияния низкой температуры, избытка цинка и их возможного взаимодействия на физиологические показатели и процессы у растений пшеницы был использован двухфакторный дисперсионный анализ (табл. 5). Его результаты показали, что избыток цинка и низкая температура, действующие как по отдельности, так и в сочетании, оказывают сильное ингибирующее влияние на большинство из изученных нами показателей. Причем с увеличением экспозиции отрицательный эффект совместного воздействия изученных факторов на растения усиливается.

ОБСУЖДЕНИЕ

Озимая пшеница относится к холодоустойчивым злакам, обладающим высокой способностью к низкотемпературной адаптации. В ее основе лежат многочисленные взаимодополняющие структурно-функциональные изменения, происходящие в том числе и на уровне отдельных физиологических процессов. К таким изменениям относятся торможение роста растений, закрытие устьиц, замедление скорости фотосинтеза и транспирации [2, 12–15] и др. Подобные изменения наблюдались и в наших опытах при воздействии температуры 4°С на проростки пшеницы при сбалансированном минеральном питании. Очевидно, эти изменения, по крайней мере отчасти, способствовали повышению холодоустойчивости проростков, о чем свидетельствует частичное восстановление к концу опыта скорости ассимиляции СО₂, увеличение сухой биомассы побега, сохранение водного обмена растений, а также повышение холодоустойчивости клеток листьев.

Проростки пшеницы, находившиеся в условиях избытка цинка, к началу холодового воздействия имели меньшую (по сравнению с растениями в оптимальных условиях минерального питания) высоту побега и его биомассу, их листья содержали меньше пигментов, кроме того, они характеризовались более низкими значениями устьичной проводимости и интенсивности фотосинтеза. Тем не менее, при 22°С, несмотря на высокое содержание металла в надземных органах, растения продолжали свой рост, поддерживали высокий уровень оводненности тканей побега, а к завершению опыта у них даже было отмечено некоторое повышение ряда изученных физиологических показателей, что, по-видимому, объясняется эффективной работой механизмов детоксикации цинка в клетке.

При воздействии низкой температуры у растений заметно снижались все изученные физиологические показатели. При этом, если в варианте опыта с оптимальным содержанием цинка спустя 3 суток наблюдалось частичное восстановление большинства изученных параметров, то при избытке металла в корнеобитаемой среде ингибирующий эффект воздействия стресс-факторов к концу опыта усиливался. Особенно это касается фотосинтеза, скорость которого снизилась более чем в 5 раз. Столь сильное замедление интенсивности фотосинтеза в этих условиях могло быть вызвано целым рядом причин, связанных с негативными эффектами цинка на ФСА. Например, известно, что в присутствии избытка цинка у растений увеличиваются размеры вакуоли, что обусловлено необходимостью изоляции в них комплексов хелатирующих молекул с ионами металла, а размеры хлоропластов, наоборот, уменьшаются и в них наблюдается деградация тилакоидов стромы [16, 17]. Вместе с тем, для поддержания требуемой скорости фотосинтеза в условиях действия холода необходимы такие изменения как уменьшение площади, занимаемой вакуолью в клетках, и увеличение площади, занимаемой хлоропластами, в которых преобладают тилакоиды стромы [18, 19]. Цинк в высокой концентрации нарушает также процесс фотоокисления воды из-за замены иона марганца в Mn-содержащем кластере и взаимодействует с кофакторами переноса электронов в реакционном центре ФС II, в частности, с пластохиноном (Q_А) [20]. Последнее ведет к нарушениям в протекании световых реакций фотосинтеза, а в дальнейшем к замедлению скорости поглощения СО₂. Укажем также на уменьшение количества хлорофиллов у растений в присутствии высоких концентраций цинка, что отмечено как в наших опытах, так и другими авторами [21, 22]. Важными причинами замедления скорости фотосинтеза в стрессовых условиях, как известно, могут быть и различные нарушения в ФС II. Однако в условиях нашего эксперимента, судя по отсутствию значительных изменений показателя F_v/F_m – индикатора фотохимической активности фотосинтетического аппарата, это не происходило. Поскольку поддержание высокой скорости фотосинтеза при низких температурах чрезвычайно важно для перестройки метаболизма, которая необходима для успешной адаптации растений к холоду [23], значительное замедление этого процесса, наблюдаемое при избытке цинка, могло негативно отразиться на их способности к адаптации.

Необходимо также отметить важность поддержания оводненности клеток и тканей для сохранения жизнеспособности растений в условиях действия холода. Известно, что закрытие устьиц и снижение устьичной проводимости является одной из первых реакций растений на охлаждение, что позволяет им избежать обезвоживания. При этом холодостойкие виды способны поддерживать водный потенциал и при закрытых устьицах [24]. Однако под влиянием высоких концентраций цинка водный потенциал растений [25], и осмотический потенциал [26] снижаются. Это приводит к нарушениям в водном обмене и потере воды клетками, что, очевидно, и наблюдалось при воздействии на проростки пшеницы температуры 4°С в условиях избытка цинка.

Судя по полученным данным, действие низкой температуры на растения озимой пшеницы при избытке цинка оказывает более сильное отрицательное влияние на большинство изученных нами физиологических показателей по сравнению с растениями, находящимися в оптимальных условиях минерального питания, что подтверждают и данные дисперсионного анализа (табл. 5). Очевидно, подобный эффект во многом связан с усилением негативного влияния цинка на ФСА и водный обмен в условиях низкой температуры. Сходный вывод следует и из результатов, полученных в работе других авторов, где изучалось влияние высокой концентрации кадмия в корнеобитаемой среде на растения Рopulus tremula [27]. При этом проведенный авторами протеомный анализ позволил заключить, что снижение способности растений к низкотемпературной адаптации было связано, по крайней мере отчасти, с нарушением под влиянием этих двух стресс-факторов синтеза хлоропластных белков, а также белков, участвующих в метаболизме жирных кислот.

Усиление ингибирующего действия высоких концентраций цинка на ряд физиологических показателей при снижении температуры уже было отмечено нами в более ранней работе [11]. Настоящее исследование позволило убедительно доказать, что в условиях избыточного содержания цинка в корнеобитаемой среде способность растений озимой пшеницы к холодовой адаптации снижается в значительной степени из-за подавления фотосинтеза и нарушения водного обмена.

Авторы выражают благодарность сотрудникам Института леса Карельского научного центра РАН д.б.н. Н.А. Галибиной и К.М. Никеровой за помощь в определении содержания цинка в растениях.

Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания (тема № 0218-2019-0074).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.